Rhod-2, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級(jí)純（NBS7640）

（長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光鈣離子探針）

【溫馨提示】：見(jiàn)我司整理的鈣離子載體/探針（Calcium ionophores/indicators）產(chǎn)品專(zhuān)題。

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶(hù)，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品描述

Rhod-2是一種高親和力的可見(jiàn)光激發(fā)波長(zhǎng)Ca2+熒光探針。類(lèi)似于Fluo-3或Fluo-4，其激發(fā)和發(fā)射光譜不會(huì)隨著Ca2+濃度變化發(fā)生明顯的遷移，熒光信號(hào)一旦與Ca2+結(jié)合后明顯增強(qiáng)。不同于Fluo-3或Fluo-4，Rhod-2的波長(zhǎng)更長(zhǎng)（Ex/Em=549/578 nm），這一特性使其更適合具高水平自熒光信號(hào)細(xì)胞或組織的Ca2+水平檢測(cè)，還可用來(lái)檢測(cè)由光感受器和籠鎖Ca2+螯合劑光激活導(dǎo)致的Ca2+釋放。

Rhod-2, AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-2，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以?xún)龈煞鄣男问教峁褂脮r(shí)只需經(jīng)無(wú)水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲(chǔ)存液，并依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。

主要特征：

1）   長(zhǎng)波長(zhǎng)鈣離子探針，能夠與GFP和綠色熒光探針兼容；

2）   特別定位在線粒體。以羅丹明結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的Rhod-2 AM帶正電荷，以電位驅(qū)動(dòng)的方式吸收聚集在線粒體，熒光顯微鏡下觀察加載進(jìn)入細(xì)胞呈現(xiàn)點(diǎn)狀染色模式。有文獻(xiàn)認(rèn)為，Rhod-2是線粒體Ca2+的選擇性探針，不過(guò)這一理論并未得到廣泛支持。

3）   檢測(cè)平臺(tái)：熒光成像，流式細(xì)胞術(shù)，酶標(biāo)儀，高內(nèi)涵篩選（HCS）

基本特性：

1）   CAS NO：129787-64-0

2）   化學(xué)名：9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2- oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide

3）   同義名：Rhod-2, Acetoxymethyl Ester 

4）   分子式：C52H59N4O19Br

5）   分子量：1123.96

6）   外觀：紅色固體

7）   最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：549/578 nm

8）   Kd（Ca2+結(jié)合）：570NM

9）   溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

10）化學(xué)結(jié)構(gòu)式：

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

運(yùn)輸：室溫運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1）   熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）   Rhod-2從低濃度Ca2+到高濃度Ca2+的熒光增強(qiáng)程度低于Fluo-3，另外，Rhod-2的熒光信號(hào)弱于Fluo-3。

3）   乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

4）   Rhod-2, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

5）   Rhod-2, AM第一次使用，建議儲(chǔ)存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時(shí)間內(nèi)使用。

6）   為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件做出調(diào)整。

A， 試劑準(zhǔn)備

1）  配制Pluronic F-127母液：稱(chēng)取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2）  HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）   用無(wú)水DMSO溶解Rhod-2, AM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫腞hod-2, AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Rhod-2, AM中加入11.1μl 無(wú)水DMSO）。準(zhǔn)備Rhod-2, AM工作液之前，有時(shí)需要往Rhod-2, AM儲(chǔ)存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-2, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-2, AM+DMSO儲(chǔ)存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

2）   用HHBS或其他生理緩沖液將 Rhod-2, AM+DMSO儲(chǔ)存液稀釋到1-10μM的工作液。

【注①】：Rhod-2,AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Rhod-2, AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）  【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲(chǔ)存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4） 將準(zhǔn)備好的Rhod-2, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。37℃孵育20min-2h。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會(huì)降解AM，從而降低Rhod-2, AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會(huì)使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對(duì)細(xì)胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會(huì)降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如2.5mM丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7） 用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀，以及波長(zhǎng)Ex/Em=549/578 nm來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

Rhod-2 AM的應(yīng)用實(shí)例：

1）   應(yīng)用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（NBS7640）檢測(cè)順鉑（cisplatin）敏感SKOV3細(xì)胞和順鉑耐性SKOV3/DDP細(xì)胞內(nèi)線粒體Ca2+水平的變化。

Fig 1. 順鉑或ATP處理誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞線粒體Ca2+內(nèi)流，并非SKOV3/DDP細(xì)胞。A）兩種細(xì)胞系分別用ATP誘導(dǎo)處理，時(shí)間序列掃描檢測(cè)線粒體Ca2+變化，通過(guò)共聚焦顯微鏡得到數(shù)據(jù)。B）細(xì)胞用6 μg/ml順鉑處理0h，8h和16h后用共聚焦顯微鏡檢測(cè)（bar，20 μm）。

2）   應(yīng)用目的：用Ca2+熒光探針Rhod-2 AM（NBS7640）檢測(cè)順鉑（cisplatin）對(duì)HeLa細(xì)胞線粒體Ca2+水平的變化。

Fig 2. 順鉑增加細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)游離Ca2+水平。A）HeLa細(xì)胞用順鉑（2.5, 5 or 10 μg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Fluo-4 AM孵育。細(xì)胞漿Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀察（bar，40 μm）。B）Fluo-4 AM定量檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)游離Ca2+水平。C）HeLa細(xì)胞用順鉑（2.5, 5 or 10 μg/ml）處理0h，6h，12h和24h后，用熒光鈣離子探針Rhod-2 AM孵育。線粒體Ca2+濃度用共聚焦顯微鏡觀察（bar，40 μm）。D）Rhod-2 A定量檢測(cè)線粒體內(nèi)游離Ca2+水平。

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