Rhod-4, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純

【溫馨提示】：見我司整理的鈣離子載體/探針（Calcium ionophores/indicators）產(chǎn)品專題。

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

Rhod-2雖然是最受歡迎的紅色熒光Ca²⁺熒光探針，但Rhod-2的線粒體定位和細(xì)胞中高基底Ca²⁺信號使其在某些細(xì)胞應(yīng)用中嚴(yán)重受限制。另外，Rhod-2在488nm處很不理想的激發(fā)波長使其在某些只有488nm激發(fā)光源的儀器比如FLIPRTM上信號很弱。Rhod-4正是根據(jù)這些缺陷而改進(jìn)的，具有以下特征：

1）Rhod-4的最大激發(fā)和發(fā)射波長是530nm和555nm。雖Rhod-4最大激發(fā)波長是530nm，但在488nm處激發(fā)下的信號也相當(dāng)強(qiáng)（見Fig 1）。除了能在514nm，532nm和546nm的長波長激發(fā)之外，Rhod-4用氬離子激發(fā)器在488nm激發(fā)下也能得到理想的熒光信號。Rhod-4隨著增加的Ca²⁺濃度熒光信號而增強(qiáng)（555nm發(fā)射波長），一旦與Ca²⁺結(jié)合熒光約增強(qiáng)＞200倍。由于許多細(xì)胞受刺激后的Ca²⁺濃度提高通常是5~10倍，因此，Rhod-4是一款優(yōu)秀的檢測此范圍內(nèi)Ca²⁺濃度變化的高靈敏探針。

Fig 1, Rhod-4鈉鹽在含氯化鈣體系內(nèi)的激發(fā)光譜特征。

2）一旦受激動劑刺激后，Rhod-4在細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯強(qiáng)于Rhod-2（信噪比）。更重要的是，Rhod-4主要定位在細(xì)胞胞漿內(nèi)，不像Rhod-2主要定位在線粒體。另外，Rhod-4具更低的溫度依賴性的細(xì)胞加載特性，不管室溫還是37℃產(chǎn)生相似的結(jié)果。這一特征使Rhod-4比Rhod-2在HTS應(yīng)用中更有優(yōu)勢。

Rhod-4, AM是Rhod-2的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Rhod-4，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以凍干粉的形式提供，使用時只需經(jīng)無水DMSO充分溶解，配置成2~5mM的儲存液，并依據(jù)具體實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)資料調(diào)整到需要的工作濃度即可。

基本特性：

1）同義名：Rhod-4, Acetoxymethyl Ester 

2）分子量：1015.96

3）外觀：紅色固體

4）最大激發(fā)/發(fā)射波長：530/555 nm

5）Kd（Ca²⁺結(jié)合）：525NM

6）溶解性：溶于DMSO（2~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，至少一年有效。

產(chǎn)品使用： 【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件做出調(diào)整。

A，  試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液：稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無水DMSO溶解Rhod-4, AM配制成2-5mM的儲存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Rhod-4, AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Rhod-4, AM中加入12.3μl 無水DMSO）。準(zhǔn)備Rhod-4, AM工作液之前，有時需要往Rhod-4, AM儲存液中加入適量的20% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Rhod-4, AM染色工作液制備前，添加等體積20% Pluronic F-127溶液到Rhod-4, AM+DMSO儲存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

2）用HHBS或其他生理緩沖液將 Rhod-4, AM+DMSO儲存液稀釋到1-10μM的工作液。

【注①】：Rhod-4,AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Rhod-4, AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：丙磺舒或磺吡酮儲存液相當(dāng)偏堿，因此加入培養(yǎng)基后需要重新調(diào)整pH。

4）將準(zhǔn)備好的Rhod-4, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。室溫或37℃孵育30min-1h。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會降解AM，從而降低Rhod-4, AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對細(xì)胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長時間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如2.5mM丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6）室溫再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7）用適當(dāng)?shù)膬x器如激光共聚焦、流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀，以及波長Ex/Em=530/555 nm來進(jìn)行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環(huán)境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Rhod-4, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Rhod-4, AM第一次使用，建議儲存液現(xiàn)配現(xiàn)用，分裝成單次用量，嚴(yán)格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實(shí)驗(yàn)效果，盡量在短時間內(nèi)使用。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

 相關(guān)產(chǎn)品：