Fluo-4, AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針，超級純

【溫馨提示】：見我司整理的鈣離子載體/探針（Calcium ionophores/indicators）產(chǎn)品專題。

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

Fluo-4是可見光激發(fā)波長Ca²⁺熒光探針Fluo-3（貨號：NBS7636）的改良版本，通過將Fluo-3結(jié)構(gòu)上的氯離子（Cl-）替換為電子吸引力更強的氟離子（F-），使得最大激發(fā)波長往短波長偏移10nm左右。正由于這個波長更接近氬激光器的波長，則當(dāng)使用氬激光器來激發(fā)探針Fluo-4，能夠得到更強的熒光強度，比Fluo-3強一倍。另外，Fluo-4的Ca²⁺親和力幾乎接近Fluo-3（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM），因此，使用上幾乎同Fluo-3。Ca²⁺結(jié)合后的最大激發(fā)波長為494nm，最大發(fā)射波長為516nm。可通過激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀來檢測胞內(nèi)鈣離子水平的變化。

Fluo-4, AM是Fluo-4的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-4，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：273221-67-3

2）同義名：Fluo-4,Acetoxymethyl Ester

3）分子式：C51H50F2N2O23

4）分子量：1096.94

5）純度：≥95% (HPLC)

6）外觀：橙紅色粉末

7）最大激發(fā)/發(fā)射波長：494/516 nm（Ca²⁺-bound）

8）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針的優(yōu)勢：

與紫外光激發(fā)的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發(fā)Ca²⁺探針具有以下特點：

1）適用于大多數(shù)的激光共聚焦測鈣系統(tǒng)，包括共聚焦激發(fā)掃描顯微鏡以及流式細(xì)胞儀等。

2）具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化，從而降低對活細(xì)胞的光毒性。

3）Ca²⁺依賴性熒光強度增強，對Ca²⁺變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發(fā)試劑，因此更方便于多參數(shù)檢測。

6）無光譜偏移。

Fluo-4, AM相比較于Fluo-3的優(yōu)勢：

1） 激發(fā)和發(fā)射波長往短波長偏移10nm，更接近氬激光器的波長，。因此，當(dāng)使用488nm進(jìn)行熒光激發(fā)，得到更強的熒光信號，比Fluo-3強一倍。

2） 50μg小包裝供應(yīng)，使用方便，且能很好保證產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

Fluo-4, AM的應(yīng)用圖片：

Fig. 1, U2OS cells were seeded overnight at 40,000 cells per 100 μL per well in a 96-well black wall/clear bottom costar plate. The growth medium was removed, and the cells were incubated with 100 μl of 4 μMFluo-3, AMorFluo-4, AMin HHBS at 37 °C, 5% CO2incubator for 1 hour. The cells were washed twice with 200 μl HHBS, then imaged with a fluorescence microscope using FITC channel.

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.3) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1）. Fluo-4/AM 儲存液的配制 利用高質(zhì)量無水DMSO溶解Fluo-4/AM配制成2-5mM的儲存液，該儲存液可分裝于-20℃避光干燥密封保存，最長可保 存6個月，但是避免反復(fù)凍融，建議分裝保存。每次使用前需回溫至室溫。

2）. Fluo-4/AM 工作液的配制 利用合適緩沖液（如HHBS）將Fluo-4/AM稀釋成2-20μM的工作液，并添加0.04%PluronicF-127和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運 抑制劑probenecid（0.5-1mM）。 【注①】 對于大多數(shù)細(xì)胞系，建議最終濃度為4-5 μM的Fluo-4AM。細(xì)胞加載所需的指示劑的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

【注②】 Fluo-4/AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

【注③】 PluronicF-127 可以防止Fluo-4/AM在緩沖液中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

3）. 取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用緩沖液洗滌細(xì)胞3次。

【注①】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會降低Fluo-4/AM進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會使本底值略微 偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

4. 將 Fluo-4/AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)30-60min。

5. 用緩沖液（如HHBS）洗滌細(xì)胞3次，以充分去除殘留的Fluo-4/AM工作液。然后加入緩沖液覆蓋細(xì)胞。

6. 數(shù)字成像顯微鏡檢測細(xì)胞。

【注①】：某些細(xì)胞具有自體熒光會影響結(jié)果分析，需使用未加載探針細(xì)胞做對照，在結(jié)果分析時在同一波長下扣除自熒光。

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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