Coelenterazine 400 a 腔腸素400a

【溫馨提示】：見我司提供的活體成像底物-腔腸素及衍生物產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡介：

腔腸素（Coelenterazine）是在水生生物中發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)光基團（luminophore），是許多熒光素酶的作用底物，包括海腎熒光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和藪枝蟲熒光素酶（Obelia luciferase），和發(fā)光蛋白包括水母發(fā)光蛋白（Aequorin）的構(gòu)成之一。其作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶，在含分子氧的條件下，氧化腔腸素產(chǎn)生高能量的中間產(chǎn)物，在此過程發(fā)射藍色光，光波長在450~480nm。而甲蟲（或螢火蟲）熒光素/熒光素酶（FLuc）系統(tǒng)不同，其在含分子氧的條件下，還需要ATP和Mg²⁺的存在才能同時發(fā)光，光波長在550-570nm。正由于生物發(fā)光信號和底物的差異，RLuc常常與FLuc聯(lián)合用于多重轉(zhuǎn)錄報告基因研究，或用作Fluc系統(tǒng)內(nèi)螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。

腔腸素應(yīng)用甚是廣泛，包括：1）活細胞或組織的鈣離子檢測；2）細胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學(xué)發(fā)光檢測；3）基因報告基因檢測；4）動物活體檢測；5）ELISA和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）藥物高通量篩選（HTS）。

天然腔腸素（Coelenterazine Native，CTZ-Native）是自然界中存在最豐富的一種腔腸素，也是目前應(yīng)用最普遍的一種標準底物。不僅是脫輔基水母發(fā)光蛋白（APO）的底物，也是海腎熒光素酶（Rluc）和分泌型膜錨定熒光素酶（Gluc）等熒光素酶的作用底物。前者用于檢測鈣離子濃度，后者用作熒光素酶的報告基因檢測系統(tǒng)。還可用于生物共振能量轉(zhuǎn)移BRET，細胞或組織內(nèi)的超氧陰離子和過氧化亞硝基陰離子水平（ROS）的化學(xué)發(fā)光檢測等。

腔腸素400a（Coelenterazine 400a，CTZ 400a），常稱為DeepBlue C，是一種天然腔腸素衍生物，是一款良好的海腎熒光素酶（Rluc）底物，但不適合用作分泌型膜錨定熒光素酶（Gluc）底物。可用來實時監(jiān)測鈣離子濃度，報告基因分析，以及用作生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）的首選底物。腔腸素400a的最大射波峰值約在400nm，從而對GFP受體的發(fā)射峰干擾最小。腔腸素400a用在BRET2體系，該體系通常用來評估蛋白-蛋白相互作用，包括涉及G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的藥物細胞信號通路分析，是一種有效的藥物開發(fā)和篩選工具。

產(chǎn)品描述：

1）CAS NO：70217-82-2

2）化學(xué)名：2,8-Dibenzyl-6-phenyl-imidazo[1,2a]pyrazin-3-(7H)-one; 6-phenyl-2,8-bis(phenylmethyl)-imidazo [1,2-a]pyrazin-3(7H)-one;

3）同義名：CTZ 400a; 1-bisdeoxycoelenterazine; di-dehydrocoelenterazine; DeepBlueCTM; 腔腸素400a；

4）分子式：C26H21N3O

5）分子量：391.5 g/mol

6）純度：>97%

7）外觀：黃色至橙色固體

8）溶解性：溶于甲醇或乙醇，不要溶于DMSO

9）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，且保存于惰性氣體內(nèi)。至少一年有效。

產(chǎn)品使用：

一、 腔腸素400a的溶解事項

1）腔腸素400a不溶于水，接觸到空氣，水分或任何氧化劑都不穩(wěn)定。溶于甲醇或乙醇，千萬不要溶于DMSO，因會發(fā)生未知反應(yīng)引起腔腸素400a的快速降解并生成未知的代謝產(chǎn)物。

2）毒性最小的溶劑是無水乙醇，可溶解粉末配制成0.1-1mg/ml溶液，之后加入需要的緩沖液，盡量保持緩沖液pH小于7.0，因堿性條件會快速降解腔腸素400a，有時沉淀會立即產(chǎn)生。

二、 腔腸素400a的保存事項

最好在使用前，才用無水乙醇溶解腔腸素400a粉末，然后用所選的緩沖液稀釋并混勻。此時配好的工作緩沖液需靜置20-30min使其穩(wěn)定（因部分底物會發(fā)生自氧化）后才進行體外實驗。該工作液能穩(wěn)定保存幾個小時（室溫3-4h），僅微弱的信號衰減可能發(fā)生。

不建議將腔腸素400a的乙醇溶液置于-20℃或-70℃保存，因天然腔腸素及任何衍生物含有一個高能量的二氧雜環(huán)丁酮環(huán)形結(jié)構(gòu)，即使在低溫條件下都會自發(fā)降解。

三、 腔腸素工作液的配制

稱取1mg腔腸素400a粉末溶解于1ml乙醇（或甲醇）中配置成濃度為1mg/ml的母液。在使用時 需將母液用合適的緩沖液（比如PBS）稀釋成需要濃度的工作液。比如常用的工作液濃度是100μM，可使用391.5ul的1mg/ml 的母液用PBS稀釋到10ml，得到一個100uM的溶液。

BRET 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（可根據(jù)具體實驗發(fā)生變動） 詳細步驟可參考文獻：Gersting SW, et al. Bioluminescence resonance energy transfer:an emerging tool for the detection of protein-protein interaction in living cells. Methods Mol Biol. 815:253-63 (2012)。

本步驟以Rluc的融合蛋白作為能量供體，YFP的融合蛋白作為能量受體，兩者同時電轉(zhuǎn)化進入細胞，并通過加載腔腸素400a 底物來啟動氧化反應(yīng)，通過分析兩者BRET信號來研究兩個蛋白之間的相互作用。

1. 按照正常流程將能表達兩個融合蛋白的質(zhì)粒，按照3:1的比例（YFP:Rluc）共電轉(zhuǎn)染進入細胞。

2. 轉(zhuǎn)染后24h進行BRET信號的檢測。吸去培養(yǎng)液（留約30μl）后，將96孔板放到熒光酶標儀上。

3. 至少在測定前15min準備腔腸素400a工作液。

4. 用超純水清洗注射泵后，讓泵開始自動吸取配制好的400a工作液，按照每孔70μl工作液的量順序加入，使得每孔中底 物的終濃度為30μM。進樣結(jié)束后，孵育2min。之后立即進行雙波長熒光信號讀數(shù)，即Rluc信號（485nm）和BRET 信號（535nm）。

BRET信號值計算

為了能夠進行數(shù)據(jù)評估，轉(zhuǎn)染細胞的Rluc信號（485nm）應(yīng)當超過非轉(zhuǎn)染對照細胞的（平均值+9×標準誤差）的區(qū)間。

1. BRET–ratio（BRET 信號比）基于以下等式進行計算，

R=（I_A/I_D）-cf

R代表BRET比值，ID表示受體YFP熒光信號的強度（535nm），IA表示供體Rluc熒光信號的強度（485nm），cf表示校 準因子（BRETcontrol/RluccontrolD），對照樣本是指共轉(zhuǎn)染YFP 融合蛋白質(zhì)粒和不含供體第二個研究蛋白的Rluc載體的細胞熒 光信號。

2. 陽性對照，使用YFP-Rluc融合蛋白的BRET比值為1.0。

3. 若蛋白之間有陽性反應(yīng)，必須檢測到：8組蛋白樣本中至少有一組能夠產(chǎn)生超過設(shè)定閾值0.1以上的BRET信號比值。

附錄1 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性：

附錄2天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異：

注意事項：

1.      腔腸素（Coelenterazine， CTZ）及衍生物最好以完全凍干粉的狀態(tài)保存在惰性氣體內(nèi)，密封后置于-20℃或-70℃長期避光保存。管內(nèi)即使有微量空氣，也會隨著時間慢慢氧化腔腸素使其活性喪失。

2.      腔腸素（Coelenterazine， CTZ）及衍生物不建議以儲存液的形式保存，最好于實驗前配制新鮮的溶液。不建議將配好的腔腸素溶液儲存在-20℃或-70℃，因其具有一個高能量的二氧雜環(huán)丁酮環(huán)形結(jié)構(gòu)，即使在低溫條件下都會自發(fā)降解。

3.      商業(yè)化腔腸素的種類繁多，有天然腔腸素，以及各種腔腸素衍生物（比如，腔腸素h，腔腸素400a，腔腸素e，腔腸素f，腔腸素hcp）。它們對鈣離子的親和力，光譜特性，以及應(yīng)用傾向上會有差異，詳見附錄1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性，附錄2—天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異選擇適當?shù)漠a(chǎn)品。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。