膜電位熒光探針產品專題（Probes forMembrane Potential）

（線粒體膜電位、細胞質膜電位）

? 快速響應熒光探針（Fast-response fluorescent probes）

代表性：ANEP染料，RH染料

? 慢速響應熒光探針（Slow-response fluorescent probes）

代表性：短鏈碳菁類染料，JC-1染料，羅丹明123染料，DiBAC染料

一個細胞典型的質膜跨膜電位約為70mV（胞內為負電荷）。膜電位的增加和降低，分別稱為膜超極化（Membrane hyperpolarization）和去極化（Membrane depolarization），在許多生理過程中發揮關鍵作用，包括神經沖動的傳播、肌肉收縮、細胞信號和離子通道門控。電位探針（Potentiometric probes）是用來研究這些過程的重要工具，以及用于線粒體觀察（線粒體的跨膜電位約為150mV，內部基質呈負電荷），用于評估細胞活力，和用于候選新藥的高通量篩選。

電位探針（Potentiometric probes）包括陽離子或兩性苯乙烯染料，陽離子碳花菁和羅丹明，陰離子氧鎓醇。染料的歸類確定因素包括在細胞的聚集方式、反應基制和毒性。根據這些染料的光學反應、光毒性，與其他分子的相互作用，來選擇合適的電位探針滿足特定的用途。根據染料的光學反應可將其分為兩大類：

一、快速響應探針（Fast-response probes）

1.1 工作原理

快速響應探針（通常為苯乙烯吡啶鹽染料）通過電子結構的變化引起熒光特征變化來工作，對周圍的電子場變化做出反應（見圖1）。在興奮細胞中其光學反應足夠快以檢測瞬時電位變化（毫秒ms），包括單一神經元、心肌細胞和完整大腦。然而，它們電位依賴性的熒光變化數量級通常很小。快速響應探針通常情況每100mV產生2-10%的熒光變化。

圖1. 膜電位敏感探針的反應基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應探針經歷電子場驅動的分子內電荷分布變化，從而產生對應的光譜特征或熒光強度變化（本圖通過顏色標示變化來闡述）。慢速響應探針是親脂性陰離子（本圖）或陽離子通過電泳機制轉跨膜轉運。熒光變化與跨膜重新分布相關（本圖通過顏色標示變化來闡述），歸因于探針對胞內和胞外環境的敏感性。因此，電位反應速度直接體現基礎過程所需的時間常數——電子的快速分子內重新分布&完整分子相對較慢的跨膜運動。

1.2 快速響應探針種類

◇ ANEP染料

ANEP (AminoNaphthylEthenylPyridinium)染料由Leslie Loew和同事開發，是最靈敏的快速響應探針。兩性離子的di-4-ANEPPS（貨號：NBS3227）和di-8-ANEPPS（貨號：NBS3228）在各種組織、細胞和模型膜系統中表現出相當一致的熒光變化速率（10%熒光變化/100mV）。ANEP染料毫秒級的時間特征彌補其中等響應振幅（見圖2）。di-4-ANEPPS（貨號：NBS3227）非常快速被細胞內在化，阻止其用在除極短期實驗之外的應用中，然而，di-8-ANEPPS（貨號：NBS3228）能更好的保留在質膜的外層。另外，雖然兩種染料都具有良好的光穩定和低毒性，報道提及di-8-ANEPPS（貨號：NBS3228）比di-4-ANEPPS（貨號：NBS3227）具微好的光穩定性和顯著更低的光毒性。

與其他的苯乙烯染料相似，ANEP染料在水溶性溶液內基本無熒光，呈現的光譜特征強烈取決于所處環境。與磷脂小體結合后，di-8-ANEPPS（貨號：NBS3228）最大吸收/發射波長約為467/631nm，相對在甲醇內的最大激發/發射約為498/713nm。di-4-ANEPPS（貨號：NBS3227）結合到神經膜的最大激發/發射波長約為475/617nm。

di-8-ANEPPS（貨號：NBS3228）和di-4-ANEPPS（貨號：NBS3227）兩者皆對膜電位（超極化）增加做出響應，~440nm激發處熒光降低，而530nm處激發熒光增加。這些光譜的遷移允許使用比率法來關聯化膜電位與熒光信號變化。

圖2. 使用快速響應探針di-4-ANEPPS檢測兔完整心臟的動作電位（Detection of action potentials in intact rabbit hearts using the fast potentiometric probe di-4-ANEPPS）。Excised rabbit hearts were loaded with di-4-ANEPPS by perfusion with dye-containing medium. Fluorescence was excited at 488 nm by an argon-ion laser. Emission components at 540 ± 6 nm (green) and >610 nm (red) were detected simultaneously by two photomultipliers (panel A). The ratio of the green to red signals (panel B) displayed a larger fractional change during action potential cycles than either of the component signals; it also followed transmembrane voltage contours recorded simultaneously by an intracellular microelectrode (panel C). In addition, fluorescence ratio measurements reduce the motion artifacts that typically distort optical signals detected from contracting hearts. Figure reproduced with permission from Am J Physiol Heart Circ Physiol (2000) 279:H1421.

◇ RH染料

最先由Rina Hildesheim合成，RH染料包含一系列dialkylaminophenylpolyenylpyridinium染料，主要用于神經元的功能成像。大量RH染料類似物的存在反映一種現象就是沒有一種單一染料能提供所有實驗條件需要的光學反應。目前，最廣泛使用的RH染料是RH 237（貨號：NBS3214）、RH 414（貨號：NBS3216）、RH 421（貨號：NBS3215）和RH 795（貨號：NBS3217）。不同類似物染色的生理效應并非完全相同。例如，用RH 414（貨號：NBS3216）染大腦皮層引起動脈收縮，用RH 795（貨號：NBS3217）則不會。體外對海馬腦片或體內對貓和猴子視覺皮質（單細胞記錄）進行檢測，RH795產生可忽略的副反應。

與ANEP染料相似，RH染料對膜電位變化做出反應，產生可變程度的熒光激發和發射光譜遷移。它們的吸收和熒光光譜也強烈取決于所處環境。RH414結合到磷脂小體上的光譜類似于神經元質膜上的。結合使用RH染料和熒光鈣離子指示劑允許同時對膜電位（RH 237（貨號：NBS3214））和胞內鈣離子（Rhod-2 AM（貨號：NBS7640））進行心肌單細胞層的成像檢測。

1.3 快速響應探針特征和應用匯總

二、慢速響應探針（Slow-response probes）

2.1 工作原理

慢速響應探針根據跨膜分布表現出電位依賴的變化，隨之是熒光的變化（見圖3）。

圖3. 膜電位敏感探針的反應基制（Response mechanisms of membrane potential–sensitive probes）。快速響應探針經歷電子場驅動的分子內電荷分布變化，從而產生對應的光譜特征或熒光強度變化（本圖通過顏色標示變化來闡述）。慢速響應探針是親脂性陰離子（本圖）或陽離子通過電泳機制轉跨膜轉運。熒光變化與跨膜重新分布相關（本圖通過顏色標示變化來闡述），歸因于探針對胞內和胞外環境的敏感性。因此，電位反應速度直接體現基礎過程所需的時間常數——電子的快速分子內重新分布&完整分子相對較慢的跨膜運動。

2.2 慢速響應探針種類

◇ 碳花菁染料（DiI, DiS and DiO Derivatives）

帶短烷基尾（<7個碳原子）的DiI，DiS和DiO屬于第一代開發的電位熒光探針。這些陽離子染料聚集在超極化的膜上，然后轉運進入脂質雙分子層。聚集進入封閉的膜內部通常引起降低的熒光，雖然變化幅度和熒光反應的方向強烈取決于染料濃度和染料的結構特征。

DiOC6(3) (貨號：NBS3219) 是最廣泛使用的膜電位測定用碳花菁染料，緊隨其后的是DiOC5(3) (貨號：NBS3224) 。流式測定中，碳花菁熒光強度的測定不僅取決于膜電位，也受細胞大小影響。某些情況下，前散射熒光的測定通常用來標準化細胞大小變量引起的光學變量。熒光比率法采用DiOC2(3) (貨號：NBS3218) 在發射光譜內的電位依賴紅光遷移來測定細菌膜電位（見圖4）。碳花菁染料，特別是thiacyanines（比如DiSC3(5)，貨號：NBS3224），能抑制呼吸，因此可能具有相對細胞毒性。

圖4. 金黃色葡萄球菌菌群經30μM DiOC2(3)染色的雙色流式分析圖（Two-color flow cytometric analysis of Staphylococcus aureus populations stained with 30 μM DiOC2(3) in the presence (red) or absence (blue) of the metabolic uncoupler CCCP. N ote the variability (~100-fold range) of the green and red fluorescence intensities. B) The same data expressed as red/green fluorescence intensity ratios. Ratio values are calculated by subtracting the logarithmic green fluorescence channel value from the corresponding logarithmic red fluorescence channel value.

◇ JC-1和JC-10

JC-1 (貨號：NBS3203)在低濃度或低膜電位下呈綠色熒光單體，然而，在更高濃度（水溶性濃度＞0.1uM）或更高電位，形成紅色熒光的J-聚集體（J-aggregates），具寬激發光譜和非常窄的發射光譜。由于J-聚集體形成的增加與一定范圍內（30-180mV）膜電位的變化呈線性關系，這一現象則可被電位測定所采用（見圖5 JC-1工作原理示意圖）。相對于質膜，JC-1更特異性識別線粒體膜電位。比其他的陽離子染料比如DiOC6(3)和羅丹明123，去極化響應的持續性更好。

各種類型的比率測定都可進行，通過組合綠色熒光JC-1單體（Ex/Em~514/529nm）和紅色熒光J-聚集體（Ex/Em~585/590nm），后者能在485nm-最大吸收波長的范圍內被有效激發。用于檢測熒光素（FITC）和四甲基羅丹明的光學濾片能分別用來檢測單體和聚集體形式。另外，兩種形式能同時用熒光素長通光學濾片設置來檢測。對于流式檢測，JC-1能用488nm激發，通過二元模式分別用綠色通道檢測單體和紅色通道檢測J-聚集體。

JC-1普遍用于檢測凋亡細胞的線粒體去極化（JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒，貨號：NBS3204）和分析多藥耐藥細胞。也常用來評估基于細胞高通量測定的線粒體功能評估。JC-10是JC-1的升級版本，熒光特征類似于JC-1，探針本身具更好的水溶性。

圖5. JC-1進入線粒體和生成J-聚集體的示例流程圖（Schematic illustration depicting JC-1 entry into the mitochondria and the generation of J aggregate）。JC-1，陽離子碳菁類染料（綠色）以膜電位依賴形式聚集在線粒體并開始形成J-聚集體（紅色）。當發生去極化，仍保持單體形式，呈綠色熒光。（文獻來源：Sivandzade F et al. Analysis of the Mitochondrial Membrane Potential Using the Cationic JC-1 Dye as a Sensitive Fluorescent Probe. Bio Protoc. 2019 Jan 5;9(1). PMID: 30687773）

◇ Rhodamine 123, TMRM and TMRE

羅丹明123（貨號：NBS3208）普遍用做線粒體的結構標志物和線粒體活性的指示劑。

TMRM（貨號：NBS3231）和TMRE（貨號：NBS3230）分別是四甲基羅丹明的甲酯和乙酯形式，結構非常類似于羅丹明123。主要用作線粒體膜電位感應器。與羅丹明123（貨號：NBS3208）一樣，這些陽離子染料聚集在線粒體，由于自淬滅熒光減弱。TMRM（貨號：NBS3231）和TMRE（貨號：NBS3230）比羅丹明123能更快的穿過質膜，它們的強熒光允許使用低濃度的探針，從而避免探針聚集。大鼠心肌細胞，TMRM（貨號：NBS3231）與X-rhod-1 AM同時使用共聚焦成像線粒體膜電位和鈣離子。活細胞內TMRE（貨號：NBS3230）成功用于高通量篩選影響線粒體膜電位的藥物。

◇ DiBAC（Bis-Oxonols）

三種雙巴比妥酸氧鎓醇，通常統稱為DiBAC染料，形成一個光譜與眾不同的的電位探針家族，最大激發波長約為490nm（DiBAC4(3) (貨號：NBS3220) ），530nm（DiSBAC2(3) (貨號：NBS3221)）和590nm（DiBAC4(5) (貨號：NBS3222) ）。有幾篇文章簡單定義這些染料為雙氧鎓醇（bis-oxonol），則總是很難確定到底用的是哪一種染料。不過，大量使用雙氧鎓醇（bis-oxonol）的文章使用的主要為DiBAC4(3) (貨號：NBS3220)。

這些染料進入去極化細胞，與胞內蛋白或膜結合，表現處熒光增強和紅光遷移。去極化越高，內流進入細胞的陰離子染料越多，則熒光增加。相反，超極化隨之而來的是熒光降低（圖6）。與陽離子碳菁類染料相反，陰離子雙氧鎓醇大體被線粒體排斥，主要對細胞質膜電位敏感。DiBAC4(3) (貨號：NBS3220)產生的電位依賴熒光變化典型為~1%/mV。陰離子氧鎓醇和陽離子K+-纈氨霉素復合體之間的相互作用使得在校準電位反應時用此離子載體變得復雜化。氧鎓醇類染料對各種離子通道和受體呈現出已知的藥理活性。因此，在使用這些熒光探針的任何實驗的情況下，都需要確定實驗本身得到的生理效應與外用加入探針濃度是無關聯的，這一步驟十分重要。

圖6. Detection of ATP-sensitive potassium (KATP) channel activation in isolated capillaries from guinea pig hearts using DiBAC4(3), a slow potentiometric probe. Application of a K+ channel opener (HOE 234) induced membrane hyperpolarization, resulting in a net efflux of intracellular DiBAC4(3), which is registered as a decrease of fluorescence intensity. These effects were reversed by subsequent treatment with the channel blocker glibenclamide.（文獻來源：Langheinrich U et al. Hyperpolarization of isolated capillaries from guinea-pig heart induced by K+ channel openers and glucose deprivation. J Physiol. 1997 Jul 15;502 ( Pt 2):397-408. PMID: 9263919）

2.3 慢速響應探針特征和應用匯總

2.5 慢速響應探針產品信息

相關產品（電位探針校準用）：