Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專題

背景介紹：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，是最受歡迎的熒光探針之一，用來標記和監測活細胞的細胞功能。具有細胞膜滲透性，一旦進入細胞，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（Calcein），產生強烈的綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因不具細胞膜滲透性，從而能被保留在細胞內。

然而，Calcein, AM的單一熒光使其很難用于多標實驗，特別是Calcein與GFP完全重疊的熒光光譜，使其不可能用在GFP轉染細胞的多色標記實驗。為了克服這一缺陷，我司開發出Calcein Red和Calcein Deep Red兩種類似物，使其能夠替代Calcein AM用在活細胞的標記和功能分析的多重標記研究。

幾種探針的基本特征：

表1 幾種鈣黃綠素（Calcein）系列探針的光譜特征

應用圖片：

文獻1：Yoshinori Hiraoka et al. Rapid Assessment of the Physiological Status of the Polychlorinated Biphenyl Degrader Comamonas testosteroni TK102 by Flow Cytometry. Appl Environ Microbiol. 2002 Apr; 68(4): 2031–2035.

圖1：睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosteroni）菌株TK102經Calcein, AM，PI雙染后的熒光顯微檢測圖片。（A）活細胞，僅有綠色熒光；（B）死細胞，僅有紅色熒光；（C）透化處理細胞，中心是紅色熒光，外緣是綠色熒光。

Fig 2. HeLa活細胞經Calcein Red（# MX3013）染色圖。

操作流程（以Calcein Red，NBS2016為例）：

A， 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Red AM（Mw：1015.79）內加入196 μl 細胞培養級別的DMSO即可。儲存液需要根據單次用量分裝，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此種情況下可穩定保存數月。

B，20% Pluronic F-127制備【可選】

稱取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

C，染色步驟

大多數實驗體系中Calcein Red AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein Red AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1）取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Red AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Red AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Red AM溶液不可長期保存，需現配現用。

2）對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞。

3）去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4）用1/10細胞培養基體積的Calcein Red AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：1）若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低去酯化的Calcein Red泄露到胞外；2）降低探針加載溫度，可能會減少探針區室化現象。

5）用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗；

6）用含合適濾光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的儀器進行檢測。 

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注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。