線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒

JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-1

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-1為熒光探針，快速且靈敏的檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位△Ψm位的理想熒光探針。JC-1染料以電勢(shì)依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）。JC-1不僅可用于定性檢測(cè)，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測(cè)，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線粒體膜電位喪失的陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于六孔板樣品，本試劑盒可檢測(cè)100個(gè)樣品。

保存條件: 

-20℃保存，1年有效。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1.  JC-1染色工作液制備

對(duì)于六孔板，每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推；對(duì)于細(xì)胞懸液每50～100萬(wàn)細(xì)胞需0.5mL JC-1染色工作液。

取適量JC-1（200×），按照每50μL JC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mL JC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

【注意】：必須先把JC-1（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后，才可加入JC-1染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-1染色緩沖液（1×）再加入JC-1（200×），這樣JC-1會(huì)很難充分溶解，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)。

2.  陽(yáng)性對(duì)照的設(shè)置

CCCP（10mM）推薦按1∶1000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細(xì)胞20min。隨后按照下述方法裝載JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè)。

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常10μM CCCP處理20 min后線粒體的膜電位會(huì)完全喪失，JC-1染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng)JC-1染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞，CCCP的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定。

3.  對(duì)于懸浮細(xì)胞

1）  取10～60萬(wàn)細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

2）  加入0.5mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min。

3）  孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）  37℃孵育結(jié)束后，600×g 4℃離心3～4min沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

5）  用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入1mL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細(xì)胞，棄上清。

6）  再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析。

4.  對(duì)于貼壁細(xì)胞

【注意】：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可以先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1）  對(duì)于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可用PBS或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入1mL細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

2）  加入1mL JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20min。

3）  孵育期間，按照每1mL JC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）  37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。

5）  加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

6）  熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5.  對(duì)于純化的線粒體

1）  將配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。

2）  0.9mL 5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。

3）  用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan），激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為485nm時(shí)，可在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)。另外，也可以參考下面步驟6中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè)。

4）  用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6.  熒光觀測(cè)和結(jié)果分析

檢測(cè)JC-1單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為490nm，發(fā)射光設(shè)置為530nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為525nm，發(fā)射光設(shè)置為590nm。

【注1】：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)可使用常來檢測(cè)碘化丙啶或者Cy3用的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。檢測(cè)JC-1單體可使用常來檢測(cè)FITC或GFP的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

注意事項(xiàng)：

1.      JC-1（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi)，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2.      裝載完JC-1后用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使JC-1染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時(shí)洗滌效果較好。

3.       JC-1探針裝載完并洗滌后盡量在30min內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。在檢測(cè)前需冰浴保存。

4.      請(qǐng)勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1染色緩沖液（5×）。

5.      如果發(fā)現(xiàn)JC-1染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在37℃加熱促進(jìn)溶解。

6.      CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請(qǐng)注意小心防護(hù)。

7.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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