JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒

JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit

產品簡介：

JC-10線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-10為熒光探針，快速且靈敏的檢測細胞、組織或純化線粒體膜電位變化的試劑盒。因線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-10是一種新型的用來監測線粒體膜電位變化的熒光探針，是JC-1的優越替代物。與JC-1相比，具有以下幾個重要優勢：1）溶解性得以改良——在水溶液中形成沉淀可能性明顯降低；2）使用更方便——簡化步驟將手動操作時間最小化；3）熒光信號更高——改良的信號與背景熒光的信噪比；4）結果更穩定——優化探針以保證更連續性和穩定性結果。

JC-10是一種替換JC-1，用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。JC-10以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內，可以用來檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。正常線粒體內，JC-10聚集在線粒體基質中形成聚合物，聚合物發出強烈的紅色熒光（Ex=540 nm, Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-10只能以單體的形式存在于胞漿中，產生綠色熒光（Ex=490 nm, Em=525 nm）。JC-10不僅可用于定性檢測，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強度的比例來衡量。

本試劑盒提供CCCP用作線粒體膜電位喪失的陽性對照。對于六孔板樣品，本試劑盒可檢測100個樣品。

保存條件: 

-20℃保存，1年有效。

產品組成：

產品使用：

1. C-10染色工作液制備

對于六孔板，每孔所需 JC-10 染色工作液的量為1ml，其他培養器皿的JC-10 染色工作液的用量以此類推；對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mL JC-10染色工作液。

取適量JC-10（200×），按照每50μL JC-10（200×）加入8mL 超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-10。然后再加入2mL JC-10 染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-10染色工作液。

【注意】：必須先把JC-10（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后，才可加入JC-10染色緩沖液（5×）。不可先配制JC-10染色緩沖液（1×）再加入JC-10（200×），這樣JC-10會很難充分溶解，會嚴重影響后續的檢測。

2.  陽性對照的設置

CCCP（10mM）推薦按1∶1000 的比例加入到細胞培養液中，稀釋至10μM，處理細胞20min。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。

對于大多數細胞，通常10μM CCCP處理20 min后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-10 染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經JC-10 染色后應顯示綠橙色熒光。對于特定的細胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。

3. 對于懸浮細胞

1） 取10～60萬細胞，重懸于0.5mL 細胞培養液中，細胞培養液中可以含血清和酚紅。

2） 加入0.5mL JC-10 染色工作液，顛倒數次混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期間，按照每1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4）  37℃孵育結束后，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。

5） 用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次：加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。再加入1mL JC-10 染色緩沖液（1×）重懸細胞，600×g 4℃離心3～4min沉淀細胞，棄上清。

6）   再用適量JC-10 染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4. 對于貼壁細胞

【注意】：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的方法進行檢測。

1） 對于六孔板的一個孔，吸除培養液，根據具體實驗如有必要可用PBS 或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL 細胞培養液。細胞培養液中可以含有血清和酚紅。

2） 加入1mL JC-10 染色工作液，充分混勻。細胞培養箱中37℃孵育20min。

3） 孵育期間，按照每1mL JC-10 染色緩沖液（5×）加入4mL 蒸餾水的比例，配制適量的JC-10 染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。

4） 37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-10 染色緩沖液（1×）洗滌2 次。

5） 加入2mL 細胞培養液，培養液中可以含有血清和酚紅。

6） 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5.  對于純化的線粒體

1） 將配制好的JC-10 染色工作液再用JC-10 染色緩沖液（1×）稀釋5 倍。

2） 0.9mL 5 倍稀釋的JC-10 染色工作液中加入0.1mL 總蛋白量為10～100μg 純化的線粒體。

3） 用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（time scan），激發波長為490nm，發射波長為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發波長不能設置為490nm 時，可在475～520nm 范圍內設置激發波長。另外，也可以參考下面步驟6 中的波長設置進行熒光檢測。

4） 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6. 熒光觀測和結果分析

檢測 JC-10 單體時可以把激發光設置為490nm，發射光設置為525nm；檢測JC-10聚合物時，可以把激發光設置為540nm，發射光設置為595nm。

【注1】：此處測定熒光時不必把激發光和發射光設置在最大激發波長和最大發射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-10聚合物時可使用常來檢測TRITC用的標準帶通濾波器。檢測JC-10單體可使用常來檢測FITC或GFP的標準帶通濾波器。出現綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現綠橙色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態也比較正常。

【注2】：由于紅色的JC-10信號淬滅比綠色快，所以用標準帶通濾波器檢測時先檢測紅色熒光。

注意事項：

1.      JC-10（200×）在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可以20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

2.      裝載完JC-10后用JC-10染色緩沖液（1×）洗滌時，使JC-10染色緩沖液（1×）保持4℃左右，此時洗滌效果較好。

3.      JC-10探針裝載完并洗滌后盡量在30min內完成后續檢測。在檢測前需冰浴保存。

4.      請勿把JC-10染色緩沖液（5×）全部配制成JC-10染色緩沖液（1×），本試劑盒使用過程中需直接使用JC-10染色緩沖液（5×）。

5.      如果發現JC-10染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，可在37℃加熱促進溶解。

6.      CCCP為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒，請注意小心防護。

7.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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