Fura-FF AM , Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Fura-FF是鈣離子指示劑Fura-2（貨號(hào)：NBS7642，貨號(hào)：NBS7663）的二氟化衍生物。與Fura-2不同，Fura-FF對(duì)鎂離子（Mg²⁺）基本不敏感，減少了該離子帶來(lái)的測(cè)定干擾。Fura-FF比Fura-2，呈現(xiàn)出更高的鈣離子解離常數(shù)（K_d=6μM versus 0.14μM）。然而，兩者的光譜特征類似，體系不含鈣離子時(shí)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)是365/514nm，當(dāng)體系含高濃度鈣離子時(shí)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)遷移到339/507nm。低親和鈣離子染料，包括：Fura-FF，更傾向于研究含高濃度鈣離子的細(xì)胞器（比如：線粒體），或具相對(duì)較低鈣離子緩沖能力的細(xì)胞系統(tǒng)，比如：神經(jīng)元樹(shù)突和神經(jīng)樹(shù)突棘。
  Fura-FF AM是Fura-FF的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fura-FF，從而滯留在胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。

產(chǎn)品特性：

1）CAS NO：348079-12-9

2）化學(xué)名：2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-5-[2-[6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl] amino]-2,3-difluorophenoxy]ethoxy]-2-benzofuranyl]-5-oxazolecarboxylic acid(acetyloxy)methyl ester

3）同義名：Fura-2FF, AM; Fura-FF, Acetoxymethyl Ester;

4）分子式：C₄₃H₄₃F₂N₃O₂₄

6）最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：365/514 nm（Ca²⁺-free），339/507 nm（high Ca²⁺-bound）

7）溶解性：溶于DMSO（5mM）

8）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。 

產(chǎn)品使用：

A， 試劑準(zhǔn)備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg  Pluronic F-127粉末（貨號(hào)：NBS2009-1g）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理緩沖液

1） 用無(wú)水DMSO溶解Fura-FF AM配制成2-5mM的儲(chǔ)存液，或?qū)⒁雅浜玫?span>Fura-FF AM儲(chǔ)存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fura-FF AM中加入12.2μl 無(wú)水DMSO）。準(zhǔn)備Fura-FF AM工作液之前，有時(shí)需要往Fura-FF AM儲(chǔ)存液中加入適量的10% Pluronic F-127溶液，以增強(qiáng)AM探針的水溶性。

【注①】：Fura-FF AM染色工作液制備前，添加一定體積的10% Pluronic F-127溶液到Fura-FF AM + DMSO儲(chǔ)存液，從而使Pluronic F-127的最終工作濃度約為0.02%。

【注②】：Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進(jìn)入細(xì)胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將 Fura-FF AM+DMSO儲(chǔ)存液稀釋到1-20μM的工作液。

【注①】：Fura-FF AM應(yīng)用在大部分細(xì)胞的推薦加載濃度為2-5μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

【注②】：Fura-FF AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）【可選】如果細(xì)胞內(nèi)（比如CHO細(xì)胞）含有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，丙磺舒（Probenecid，1-2.5mM）或磺吡酮（Sulfinpyrazone， 0.1-0.25mM）可能需要加入細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，以降低去酯化探針的泄露水平。

4） 將準(zhǔn)備好的Fura-FF AM染色工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。室溫或37℃孵育20-120min。

【注①】：若使用含血清的培養(yǎng)基，血清內(nèi)酯酶會(huì)降解AM，從而降低Fura-FF AM加載效果。而含酚紅培養(yǎng)基會(huì)使本底值略偏高，建議加入染色工作液前，對(duì)細(xì)胞清洗2~3次。

【注②】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30min，看熒光效果；如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

【注③】：降低探針加載溫度可能會(huì)降低探針的區(qū)室化現(xiàn)象。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）清洗細(xì)胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 室溫再孵育30min以保證細(xì)胞內(nèi)AM的完全去酯化。

7） 用合適的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)熒光。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請(qǐng)?jiān)诟稍锏沫h(huán)境放至室溫后再開(kāi)封。由于試劑微量，開(kāi)封前請(qǐng)將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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