pH熒光探針（紅600, SE）

產品簡介：

pH Red熒光染料展現出獨特的pH依賴性熒光特性。與大多數在堿性條件下熒光更強的傳統染料不同，該染料在酸性環境中熒光信號會顯著增強。當pH值從中性降至酸性范圍時，其熒光強度呈現急劇上升的趨勢

pH Red在細胞外僅表現出微弱熒光，這一特性使得實驗過程中可能無需洗滌步驟，大大簡化了操作流程。pH Red染料為監測內體、溶酶體等酸性細胞區室提供了強有力的研究工具。雖然它在細胞外熒光較弱，但在吞噬體、溶酶體和內體等酸性環境中熒光會顯著增強。這種特性使pH Red能夠特異性地檢測細胞內的酸性區室，同時降低信號變異，顯著提高了成像和流式檢測的準確性。此外，該染料還可與GFP、Fluo-8、鈣黃綠素或FITC標記抗體等綠色熒光染料配合使用，實現細胞多功能分析。

pH Red 600，SE（琥珀酰亞胺酯衍生物）可輕松與各類生物分子偶聯，用于成像或流式檢測，實現對吞噬作用和內吞作用的 高精度、低變異 特異性檢測。這些偶聯物同樣適用于與綠色熒光染料（如GFP、Fluo-8、鈣黃綠素或FITC標記抗體）聯用，進行多功能細胞分析。

產品特性：

1)     分子量：953.06

2)     外觀：黑色固體

3)     溶解度：在DMSO中溶解

4)     Ex(nm)：576

5)     Em(nm)：579

pH熒光探針（紅600）的pH依賴性發射光譜

保存條件: 

-20℃避光保存，2年有效。

產品使用：（僅供參考）

一、儲備液的配制

（所有未使用的儲存液應在配制后分裝成單次使用量，并于-20°C保存。避免反復凍融。）

1. 蛋白儲存液（溶液A）

將100 μL反應緩沖液（如1M碳酸鈉溶液或pH~9.0的1M磷酸鹽緩沖液）與900 μL目標蛋白溶液（如抗體，蛋白濃度建議>2 mg/mL）混合，配制1 mL蛋白標記儲存液。

注意：

a)     蛋白溶液（溶液A）的pH值應為8.5±0.5。若pH低于8.0，需使用1M碳酸氫鈉溶液或pH 9.0的1M磷酸鹽緩沖液調節至8.0-9.0范圍。 

b)     蛋白應溶解于1X磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2-7.4）中。若蛋白溶解于Tris或甘氨酸緩沖液，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析以去除游離胺類或銨鹽（如硫酸銨、醋酸銨等蛋白沉淀常用試劑）。

c)      含雜質抗體或用牛血清白蛋白（BSA）、明膠穩定的抗體標記效果不佳。疊氮化鈉或硫柳汞可能干擾偶聯反應，建議通過透析或離心柱去除以獲得最佳標記效果。

d)     蛋白濃度低于2 mg/mL會顯著降低偶聯效率，推薦最終蛋白濃度為2-10 mg/mL。

2. pH Red 600，SE儲存液（溶液B）

向pH Red 600，SE瓶中加入無水DMSO，配制10 mM儲存液，通過移液或渦旋混勻。

注意：

a)     溶液B需在偶聯反應前新鮮配制并立即使用。長期儲存可能導致染料活性下降。 

b)     避光防潮條件下，溶液B可于冷凍保存兩周，但需避免反復凍融。

二、標記步驟

1. 標記反應（以標記山羊抗小鼠IgG為例）

本操作方案專為pH Red 600，SE與山羊抗小鼠IgG的偶聯反應而設計。針對其他特定蛋白可能需另行優化。

注意： 每種蛋白所需染料/蛋白比例各異，該比例還取決于染料特性。過量標記會損害蛋白結合活性，而標記比例過低則會導致檢測靈敏度下降。

2. 進行偶聯反應

a)     建議以10:1摩爾比（溶液B染料/溶液A蛋白），取95 μL蛋白溶液（溶液A，假設蛋白濃度為10 mg/mL，分子量~200 KD，則蛋白濃度約0.05 mM）加入5 μL染料儲存液（溶液B，10 mM），充分振蕩混勻

b)     若10:1比例效果不佳，可測試5:1、15:1及20:1等不同比例以確定最佳標記條件。

c)      室溫下持續旋轉或振蕩反應混合物30-60分鐘。

3. 偶聯物純化（以使用SephadexG-25柱純化染料-蛋白質結合物為例）

a)     根據制造商說明書準備SephadexG-25柱。

b)     將上述反應混合物裝載到SephadexG-25柱的頂部。

c)      當樣品剛好流到頂部樹脂表面下方時，立即添加PBS（pH7.2-7.4）。

d)     向所需樣品中添加更多PBS(pH7.2-7.4) 以完成柱純化。將含有染料-蛋白質結合物的各部分混合在 一起。

注意：若要立即使用，染料-蛋白質結合物需要用染色緩沖液稀釋，分裝后使用；若要長期保存，染料-蛋白質結合物溶 液需要濃縮或冷凍干燥處理。

實驗結果：

圖：用pH Red 600，SE染色的活 Jurkat 細胞圖像。活 Jurkat 細胞用 HHBS 洗滌兩次，然后用10 μM pH Red 600，SE染色30分鐘。隨后，細胞再次用 HHBS 洗滌，并重懸于 pH 4.5 緩沖液或 pH 7.2 緩沖液中。圖像在配有 TRITC 濾光片的熒光顯微鏡下拍攝。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關產品：