pH熒光探針（綠500, SE）

產(chǎn)品簡介：

pH熒光探針是一種pH敏感型熒光染料，其熒光強(qiáng)度隨環(huán)境pH值變化而顯著改變。染料在細(xì)胞外不發(fā)熒光，在酸性室（如吞噬體、溶酶體和內(nèi)體）中熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，而在中性或堿性環(huán)境中，熒光較弱。pH熒光探針使得能夠特異性檢測(cè)細(xì)胞酸性室，從而在成像或流式分析中降低信號(hào)變異性并提高準(zhǔn)確性。

產(chǎn)品特性：

1)     分子量：539.54

2)     外觀：橙色固體

3)     溶解度：在DMSO中溶解

4)     Ex(nm)：445

5)     Em(nm)：503

pH Green 500熒光探針的pH依賴性發(fā)射光譜

保存條件: 

-20℃避光保存，2年有效。

產(chǎn)品使用：（僅供參考）

一、儲(chǔ)備液的配制

以下配制好的儲(chǔ)備液請(qǐng)按照每次實(shí)驗(yàn)用量進(jìn)行分裝，并儲(chǔ)存在-20℃，避免反復(fù)凍融。

1. 蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備液（溶液A）

將100μL反應(yīng)緩沖液（例如：pH值~9.0的1M碳酸鈉溶液或1M磷酸鹽緩沖液）與900μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液（例如：濃度>2mg/mL的抗體、蛋白）混合，得到1mL蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備液（溶液A）。

【注意】

a)     蛋白質(zhì)標(biāo)記儲(chǔ)備液（溶液A）的pH應(yīng)為8.5±0.5。如果溶液A的pH值低于8.0，請(qǐng)使用1M碳酸氫鈉溶液或1M pH9.0磷酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)至8.0-9.0范圍。

b)     蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在1×磷酸鹽緩沖液(PBS)（pH7.2-7.4）中。如果蛋白質(zhì)溶解在Tris或甘氨酸緩沖液中，則必須用1×PBS（pH7.2-7.4）進(jìn)行透析，去除用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（例如硫酸銨和醋酸銨）。

c)      不純的抗體或用牛血清白蛋白(BSA)或明膠穩(wěn)定的抗體標(biāo)記效果不好。疊氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾標(biāo)記反應(yīng)，疊氮化鈉或硫柳汞可通過透析或離心柱去除，以獲得最佳標(biāo)記結(jié)果。

d)     如果目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度低于2mg/mL，結(jié)合效率會(huì)降低。為了獲得最佳標(biāo)記效率，建議目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度范圍為2-10mg/mL。

2. pH Green SE儲(chǔ)備液（溶液B）

將無水DMSO加入到pH Green SE中，制成10mM儲(chǔ)備溶液（溶液B），通過吹打或渦旋充分混合。

【注意】溶液B請(qǐng)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，在避光防潮條件下，溶液B可在-20℃保存兩周，避免反復(fù)凍融。

二、標(biāo)記步驟

1. 標(biāo)記反應(yīng)（以標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為例）

【注意】每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的特性。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)結(jié)合物會(huì)降低其靈敏度。

a)     使用摩爾比為10:1的溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）作為起始條件：將5μL溶液B（假設(shè)其染料濃度10mM）加入到裝有95μL溶液 A的離心管中，并充分搖勻。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量為~200KD，則蛋白質(zhì)濃度為~0.05mM。

【注意】我們建議使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白質(zhì)）摩爾比為10:1的溶液。如果比例太低或太高，則請(qǐng)分別在5:1、15:1 和20:1的摩爾比條件下，確定最佳染料/蛋白質(zhì)比例。

b)     繼續(xù)在室溫下攪拌或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

2. 純化（以使用SephadexG-25柱純化染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物為例）

a)     根據(jù)制造商說明書準(zhǔn)備SephadexG-25柱。

b)     將上述反應(yīng)混合物裝載到SephadexG-25柱的頂部。

c)      當(dāng)樣品剛好流到頂部樹脂表面下方時(shí)，立即添加PBS（pH7.2-7.4）。

d)     向所需樣品中添加更多PBS(pH7.2-7.4) 以完成柱純化。將含有染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的各部分混合在一起。

【注意】若要立即使用，染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物需要用染色緩沖液稀釋，分裝后使用；若要長期保存，染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物溶液需要濃縮或冷凍干燥處理。

注意事項(xiàng)：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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