活細菌/死細菌雙染試劑盒(DMAO/PI)

DMAO/PI Live/Dead Bacterial Double Stain Kit

產品簡介：

DMAO，即N, N-dimethylaniline N-oxide，是一種核酸綠色熒光染料，對于革蘭氏陽性和陰性細菌均適用，且既能染色活細菌，也能染色死細菌。該染料具有膜通透性，能透過細胞膜，優先結合雙鏈DNA。DMAO非常穩定，在室溫下進行常規操作和保存不易降解。PI是一種非滲透性熒光染料，不能穿過具有生物活性的細胞質膜，因此對于具有完整細胞膜的細菌不能染色。而對于壞死細菌，其細胞膜的完整性喪失，PI可進入細胞核并與雙鏈DNA結合，并嵌入細菌的DNA雙螺旋形成PI-DNA復合物從而產生紅色熒光，這種結合很少或幾乎沒有序列偏好，每4-5個堿基對插入一分子PI染料。將DMAO與PI聯合使用檢測細菌的死活，具有完整細胞膜的活細菌呈現綠色熒光，細胞膜受損的死細菌同時呈現綠色與紅色熒光。

DMAO-DNA復合物的最大激發光波長為503nm，最大發射光波長為530nm；PI-DNA復合物的最大激發光波長為535nm，最大發射光波長為617nm。DMAO-DNA和PI-DNA的激發光譜和發射光譜參考圖1，可分別使用FITC和Cy3通道觀察。

本品中文名稱活細菌/死細菌雙染試劑盒(DMAO/PI)，英文名稱LIVE/DEAD Bacterial Staining Kit with DMAO & PI，或LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit with DMAO and PI，也稱細菌活力檢測試劑盒(Bacterial Viability Assay Kit)或細菌毒性檢測試劑盒(Bacterial Cytotoxicity Assay Kit)，是一種高效、便捷、靈敏的基于DNA綠色熒光染料DMAO和紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium iodide, PI)的雙熒光染色法檢測細菌死活的試劑盒。本試劑盒檢測時，活細菌呈現綠色熒光，死細菌呈現綠色和紅色兩種熒光。本試劑盒可使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光酶標儀、流式細胞儀等熒光檢測系統進行檢測。

本試劑盒提供的DMAO與PI均為1000×的儲存液，溶液經過優化，對大多數細菌都適用，但為了獲得更滿意的結果，對于不同類型的細菌請自行進行一定的濃度摸索，DMAO和PI的使用終濃度一般為0.5-2×，最優先的推薦終濃度為1×。同時，本試劑盒提供檢測緩沖液，該緩沖液可用于細菌死活染色工作液的配制。

圖1.DMAO-DNA和PI-DNA的激發光譜和發射光譜。

保存條件: 

-20℃避光保存，有效期一年。

產品組成：

產品使用：(以下步驟僅用作示例以指導科研人員開展自身細菌樣本的染色)

一、培養條件和細菌懸液的制備

【注意】：用本試劑盒進行細菌染色，務必要小心去除培養基殘留，因為，核酸和其它培養基成分可能以不可預料的方式與DMAO和PI結合，導致染色結果發生不可接受的變動。簡單的一次清洗步驟通常足以去除培養基內含的培養基成分干擾物殘留。不建議使用磷酸鹽清洗緩沖液，因此可能降低染色效率。

1.1 用營養肉湯培養大腸桿菌或金黃色葡萄球菌（30ml）使其生長至對數生長后期。

1.2 于10000×g離心10-15min，濃縮25ml細菌培養物。

1.3 吸走上清液，用2ml 0.85% NaCl或適當緩沖液來重懸沉淀。

1.4 取1ml重懸菌液分別加入含20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液的30-40ml離心管（設置為活細菌組），用含20ml 70%異丙醇（也可以用其他方法比如高熱處理殺死細菌）的30-40ml離心管（設置為死細菌組）。

1.5 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于室溫孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次。

1.6 兩管樣品（分別為活細菌組和死細菌組）于10000×g離心10-15min。

1.7 用20ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸沉淀，并且按照步驟1.6再離心一次。

1.8 分別用10ml 0.85% NaCl或適當緩沖液重懸兩管樣品。

1.9 分別取3ml菌液測定670nm的光密度（OD670），用玻璃或丙烯酸酯比色皿（1cm路徑）。

1.10 對于大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的建議染色濃度，根據你的儀器類型（熒光顯微鏡、熒光光度經、熒光酶標儀）或流式細胞儀來參考相應部分的染色條件。

二、熒光顯微鏡操作步驟

2.1活菌和死菌的熒光可能用標準的熒光素長通濾片設置來同時觀察。替代方案的話，活菌（綠色熒光）和死菌（紅色熒光）可分別用雙通道：熒光素FITC和Texas Red帶通濾光片設置。用于本試劑盒檢測的建議熒光顯微鏡濾片設置見表1。

表1 適用于本試劑盒檢測用的常見濾光片特征

油鏡100×計數＞5個視野，計算存活率：存活率（%）=綠色熒光細胞數/(綠色+紅色光細胞數)×100

三、流式細胞儀操作步驟

儀器的檢測配置可能要因實際情況來調整，但此處列出的檢測技術和設置參數適用于市場上絕大多數流式細胞儀。

FL1通道： (530/30nm) DMAO (檢測活菌) 

FL3通道： (＞670nm) PI (檢測死菌) 

閾值設定：排除粒徑＜0.2um碎片（避免假陽性）

結果判斷與數據驗證分析

注意事項：

1.      由于試劑盒內DMAO和PI的組分量少，室溫回溫充分融化后，務必低速離心沉至管底后再開蓋。

2.      兩款探針溶液本身就是溶于DMSO中，所以后續無需再單獨添加，第一次使用可將DMAO和PI根據單次用量分裝保存，密封后置于≤-20℃避光保存。

3.      組分C檢測緩沖液經過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果檢測緩沖液發生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續使用。

4.      DMAO 和PI結合核酸，PI是潛在的誘變劑，目前沒有數據闡明DMAO的誘變性或毒性，兩種試劑使用都需做恰當防護。DMSO能促進有機分子進入組織。強烈建議處理DMSO儲存液時戴雙層手套。對于核酸染料，含此類染料的試劑經活性炭吸附后再進行廢液處理。活性炭之后經焚燒來破壞染料。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

常見問題及解決方案：

本產品僅用于生命科學研究，不得用于醫學診斷及其他用途！

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