Filipin III (Cholesterol fluorescent probe) 膽固醇熒光探針

產品簡介：

菲律賓菌素 III（Filipin III）是一種五烯大環內酯抗生素，是分離自菲律賓鏈霉菌（S. filipinensis）培養物的四種多烯大環內酯異構體中的占比最多的一種。歸因其發熒光且特異性結合膽固醇的特性，菲律賓菌素 III常常通過冷凍斷裂電鏡術和結合后降低的熒光來檢測膜上的膽固醇。菲律賓菌素 III用在番茄細胞中，觀察激活配體非依賴性的信號反應。通過菲律賓菌素 III和膽固醇的螯合活性，破壞正常和轉染角質細胞的脂筏，抑制AKT信號通絡。菲律賓菌素 III復合物最大激發波長是338和357nm，最大發射波長是480nm。

產品特征：

1）CAS NO.：480-49-9

2）化學名：4S,6S,8S,10R,12R,14R,16S,27S-octahydroxy-3R-(1R-hydroxy-hexyl)17,28R-dimethyl- oxacyclooctacosa-17E,19E,21E,21E,23E,25E-pentaen-2-one

3） 同義名：16,20,22,24-Octacosapentenoic acid; 16,20,22,24-Octacosapentenoic acid; 3,5,7,9,11,13,15,26,27- nonahydroxy-2-(1-hydroxyhexyl)-16-methyl-, 27-lactone; NSC3364; NSC-3364;

4）分子式：C35H58O11

5）分子量：654.8

6）純度：≥90%

7）外觀：固體

8）溶解性：溶于DMSO（10mg/ml）、DMF（5mg/ml）、乙醇（1mg/ml）、DMSO:PBS(pH 7.2)(1:4)（0.2mg/ml）

9）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少2年有效。

產品使用：

以下是針對細胞樣本的染色方法，僅作參考。用戶需根據實際染色樣本和染色條件來優化。

1、 儲存液的制備

將低溫保存的固體平衡至室溫至少20min，低速離心后，于無菌工作臺內加入適量有機溶劑（比如：無水高質量DMSO）配置成10mg/ml（=15.2718mM）的儲存液。

2、工作液的制備

于正式實驗前，用PBS、HBSS或其他生理緩沖液稀釋儲存液，到所需的工作濃度，比如：10-100μg/ml。最佳的工作濃度請參閱文獻或自行設置梯度濃度進行摸索。工作液必須現配現用。

3、 染色步驟（室溫進行）

應用示例（來自文獻，僅做參考）

1） 用Filipin III進行染色，驗證U18666A誘導吞噬體樣囊泡中的膽固醇積累。CU428和II8G-IA細胞用2μM U18666A或溶劑對照處理15min，之后加入26 μM膽固醇。1h后，樣本轉移到離心管，清洗后重懸于100μl Tris-HCl，加入等體積4%多聚甲醛-3.4%蔗糖室溫固定15min。用PBS清洗后，重懸于100μl PBS中，加入50μg/ml Filipin III（儲存液溶于DMSO，濃度是5mg/ml，充入氮氣后，-80℃凍存）室溫孵育1h，保持震蕩，最后細胞清洗2次后，重懸于40μl PBS，滴加到載玻片上進行觀察和成像分析。用UV-2A 濾波器組合觀察，用Fiji軟件進行成像處理和數據分析。

(圖1) Fluorescent microscopy. CU428 and II8G-IA cells were pretreated with 2 μM U18666A or vehicle for 15 min prior to the addition of 26 μM cholesterol. Untreated cells are designated as Control. After 1 h, cells were fixed, stained with Filipin and examined by fluorescence microscopy. Arrows indicate large, phagosome-like vesicles and arrowheads indicate selected small vesicles that were also observed in some cells. To improve visualization, some of the background fluorescence of CU428 cells was allowed, although II8G-IA cells required more contrast stretching as fluorescence levels were identical between treatments. Scale bar?=?50 μm. Results shown are representative experiment repeated three times with similar results.

2）用Filipin III進行染色，驗證MβCD處理后細胞膜膽固醇水平的降低。Vero細胞鋪板在96孔板，用不同濃度的MβCD（2.5, 5, 7.5和10 mM）誘導處理45 min。用冰PBS清洗3次，細胞用4%多聚甲醛固定。之后，細胞膜膽固醇用稀釋于PBS的50μg/ml Filipin III（儲存液溶于DMSO，濃度是25mg/ml）孵育2h。高容量成像系統基于Filipin III的熒光強度來定量細胞膜膽固醇水平。

(圖2) Vero cells were plated in 96-well plates and treated with various concentrations of MβCD (2.5, 5, 7.5, and 10 mM) for 45 min. Cell membrane cholesterol was labeled with 50 μg/mL filipin III, and images were acquired with the Operetta CLSTM High-Content Analysis System.

注意事項：

1.      為了讓化合物更好的溶解，可通過37℃加熱或（和）超聲波水浴中震動片刻來處理。若實驗所需濃度過大甚至達產品溶解極限，請添加助溶劑助溶或自行調整濃度。

2.      菲律賓菌素 III與膽固醇的相互作用會改變吸收和熒光光譜，為此，在做熒光顯微鏡成像分析時，使用340-380nm作為激發波長，385-470nm作為發射波長。

3.      菲律賓菌素 III的熒光染色漂白非常迅速，因此，染色后樣本務必盡快分析。

4.      菲律賓菌素 III溶液對光和空氣都非常敏感。條件允許的話，配置好的溶液分裝凍存，且充入惰性氣體，-80℃分裝凍存，避免反復凍融。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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