Calcein Blue, AM 鈣黃綠素藍（藍色）

【溫馨提示】：見我司整理的Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專題，尋找最合適波長的鈣黃綠素活細胞探針。

產品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性最受歡迎的活細胞熒光染料，用來標記和監測活細胞功能，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM單一顏色使其不能將其用在多重標記實驗，比如，其無法和GFP轉染細胞聯合使用，因光譜一致。為了解決這一應用缺陷，我司特別開發出Calcein Blue, AM、Calcein Red, AM等，實現聯合Calcein, AM對活細胞的多重標記和功能分析。

Calcein Blue, AM本身僅呈微弱熒光（Ex/Em~322/435nm），具有細胞膜滲透性。一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素藍（Calcein Blue），探針極性增強并能保留在細胞內數小時，此時熒光強度增強且熒光光譜遷移到更長波長（Ex/Em~360/445nm），光譜特征類似于DAPI、Hoechst 33342（CAT：NBS8032 和 CAT：NBS8033）或Hoechst

 33258（CAT：NBS8034 和CAT：NBS8035）。

產品特性：

1）  CAS NO：168482-84-6

2）  化學名：N-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]-N-[(7-hydroxy-4-methyl-2-oxo-2H-1-benzopyran-8-yl) methyl]-glycine, (acetyloxy)methyl ester

3）  同義名：Calcein Blue Acetoxymethyl ester鈣黃綠素藍乙酰氧基甲酯；

4）  分子式：C21H23NO11

5）  分子量：465.41

6）  純度：≥90%

7）  Ex/Em：360/445nm

8）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

9）化學結構圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少一年有效。

產品使用：

A， 儲存液制備

儲存液配制范圍可為1～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Blue, AM（Mw：465.41）內加入430μl 細胞培養級別的DMSO，充分溶解，混勻。儲存液根據單次用量分裝-20℃保存，避免反復凍融，數月穩定（不要超過6個月）。 

B， 20% Pluronic F-127制備【可選】

稱取100mg Pluronic F-127（CAT NO. NBS2009）粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。 

C， 染色步驟

大多數實驗體系中Calcein Blue, AM的工作濃度為2-5μM。由于不同細胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以確定Calcein Blue, AM的最佳工作濃度，以最低的探針濃度得到最好的熒光結果為篩選原則。

1）  取一管適量分裝的儲存液（1000×）置于室溫，至少回溫20min，低速離心后，用合適的緩沖液如PBS，HBSS-HEPES稀釋到1×染色工作液。

【注意】：有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Blue, AM儲存液內來增強其水溶性。制備染色工作液前，取一管Calcein Blue, AM儲存液內加入等體積的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的終濃度為0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Blue, AM溶液不可長期保存，需現配現用。

2）  對于貼壁細胞，先用胰酶-EDTA或Accutase消化細胞，離心收集細胞（1000 rpm，3min）。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞?！咀⒁狻浚嘿N壁細胞也可進行原位染色。

3）  去上清，用PBS（或者其他緩沖液）清洗細胞2~3次，以充分去除殘留的酯酶活性。

4）   用1/10細胞培養基體積的Calcein Blue, AM染色工作液重懸細胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：a）若細胞自身含有機陰離子轉運體，需加入丙磺舒（CAT NO. NBS2007）（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育體系內以降低去酯化的Calcein Blue泄露到胞外；

b）降低探針加載溫度，可能會減少探針區室化現象。

5）  用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

【注意】：如有必要，使用含有機陰離子轉運抑制劑的緩沖液來進行細胞清洗。

6）  用含合適濾光片（Ex/Em=360/445nm）的儀器進行檢測。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein Blue, AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Blue, AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Blue, AM工作液必須現配現用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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