Calcein Deep Red AM 鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯

【溫馨提示】：見我司整理的Calcein 鈣黃綠素（常用的活細胞熒光探針）專題，尋找最合適波長的鈣黃綠素活細胞探針。

產品簡介：

Calcein, AM，中文名鈣黃綠素乙酰甲酯，CAS NO：148504-34-1，一種具細胞膜滲透性最受歡迎的活細胞熒光染料，用來標記和監測活細胞功能，呈綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。然而，Calcein, AM單一顏色使其不能將其用在多重標記實驗，比如，其無法和GFP轉染細胞聯合使用，因光譜一致。為了解決這一應用缺陷，我司特別開發出Calcein Red（CAT NO.：NBS2016），Calcein Deep Red（CAT NO.：NBS2019）這些衍生物，能夠聯合GFP或FITC等熒光素實現對活細胞的多重標記和功能分析。

鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯（Calcein Deep Red AM）自身無熒光，具有細胞膜滲透性。能夠輕易進入活細胞，被細胞內酯酶水解生成鈣黃綠素深紅（Calcein Deep Red），產生強烈的深紅色熒光（Ex/Em=643/663nm），用標準的Cy5濾片設置檢測。

產品特性:

1）  同義名：Calcein Deep Red AM；Calcein Deep Red AM Ester;鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（深紅色），鈣黃綠素深紅乙酰氧基甲酯；

2）  分子量：~600

3）  純度：≥95%（HPLC）

4）  Ex/Em：643/663nm

5）  溶解性：溶于DMSO（1~5mM）

保存條件: 

-20℃干燥保存，避免強光直射，有效期一年。

應用實例:

Fig 1.HeLa細胞（活細胞+固定細胞）經Calcein Deep Red AM（CAT NO.：NBS2019）染色的圖片。

產品使用：

1、儲存液制備

儲存液配制范圍可為2～5 mM，具體根據工作濃度來決定，建議提前配制成1000×儲存液。若使用的工作液為5μM，那么可配制5mM的儲存液，即往1mg Calcein Deep RedAM（Mw ~600）內加入333μl細胞培養級別的DMSO即可。儲存液需要根據單次用量分裝，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此種情況下可穩定保存數月。

2、染色工作液制備

于正式實驗前，或溶解Calcein Deep RedAM粉末配制儲存液，或取一管已配制好的Calcein Deep RedAM儲存液并回至室溫使充分融化。用添加有2.5mM 丙磺舒（CAT NO. NBS2007）的HHBS（Hanks with 20mM Hepes buffer）或其他適當的緩沖液（pH 7.0）稀釋儲存液到5~10 μM工作濃度。

【注1：Calcein Deep Red染色工作液很不穩定，需要使用前配制。】

【注2：許多細胞都含有機陰離子轉運體。因此高度推薦染色工作液內添加2.5mM丙磺舒（有機陰離子轉運體抑制劑），以防止熒光探針泄露到細胞外。】

3、染色步驟

以下是基于96孔板的Calcein Deep Red活細胞染色步驟，僅作參考。具體實驗請根據自身要求做調整。

a. 細胞準備：于黑框/透明底的96孔微孔板內按照100~10,000個細胞/孔的量鋪板。設置空白孔（不含細胞的培養基）。【注意】：每種細胞系需要根據實際情況來確認細胞增殖或細胞毒性誘導的最佳細胞密度。增殖分析，細胞密度相對少些；毒性分析，起始細胞密度高些。建議96孔板的單孔體積為100 μL。

b. 藥物處理：加待測藥物到細胞內處理適當時間（比如24h，48h或96h）。設置空白孔（不含細胞的培養基），加入相應量的待測藥物。【注意】：藥物添加前可不用清洗細胞。然而，若是藥物是血清敏感性，那在添加藥物前需要吸掉生長培養基和血清因子。替換之細胞用無血清培養基培養。

c. 吸掉培養基。【注意】：探針加載前必須去除培養基。

d. 按照100 μL/孔（96孔板）的量加入Calcein Deep Red染色工作液。

e. 室溫或37℃避光孵育1h。

【注意1】：適當的孵育時間取決于細胞類型和使用的細胞濃度。每個實驗建議進行孵育時間優化。

【注意2】：對于懸浮細胞，探針孵育結束后，于800rpm離心2min。

f. 用含合適濾光片（Ex/Em= 643nm/663nm）的儀器進行熒光檢測。【注意：如果熒光背景高，可在熒光信號檢測前用含2.5mM丙磺舒的HHBS緩沖液替換Calcein Deep Red染色工作液。】

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底。

3.      Calcein Red AM對濕度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Red AM儲存液需要分裝避光凍存，且必須緊緊密封蓋子，干燥保存。Calcein Red AM工作液必須現配現用。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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