細胞膜熒光探針（Tracers for Membrane Labeling）產品專題

（DiI，DiO，DiD，DiR，DiA，Celltracker CM-DiI）

傳統細胞膜探針：

A，DiI, DiO, DiD和DiR：

DiI, DiO, DiD和DiR作為一類長鏈的親脂性二烷基碳菁類染料(Dialkylcarbocyanines)熒光染料家族，用于標記細胞膜以及其他脂溶性生物結構，尤其是DiI，廣泛用于活體和固定組織及細胞的神經元逆行性和順行性示蹤。

作為一類環境敏感型熒光染料，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質，雖然在水中其熒光強度很弱）結合時，其熒光強度顯著增強。一旦進入細胞后，它們在細胞內質膜中逐步擴散，最佳濃度條件下可將整個細胞染色。這些染料具很高的淬滅系數，偏光依賴性和很短的激發壽命。

四種染料呈現不同的熒光顏色，DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術提供了一種便捷的工具。DiO和DiI分別用標準FITC和TRITC濾光器檢測，可結合使用。DiD可被633 nm氦-氖（He-Ne）激光激發，具有比DiI更長的激發和發射光波長，特別適合用于標記具本底熒光的細胞和組織。而，DiR在體內活體成像或者示蹤中意義非凡，因其所發射的紅外光可以高效地穿過細胞和組織，并且在紅外光范圍內，其本底熒光水平很低。

Fig. DiO（NBS5128）、DiI（NBS5129）、DiD（NBS5131）、DiR（NBS5132）結合到磷脂雙分子層上的標準化熒光發射光譜圖。

B， DiA：

DiA為親脂性氨基苯乙烯基染料（dialkylaminostyryl dye），常用于神經元的示蹤，可與DiI聯合使用進行神經細胞的雙色標記。研究發現，某些情況下當DiO不能標記固定組織時，DiA可得到良好標記效果。DiA與磷脂雙層膜結合后，光譜遷移明顯加強。正由其發射光譜非常廣，在適當的濾光片下，可以綠色、橙色，甚至紅色熒光被檢測到。 

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C，CM-DiI（活細胞的多代示蹤、固定細胞長期示蹤）,改良的細胞膜探針：

Cell-Tracker CM-DiI為DiI的衍生物，在DiI中加入了具有中度巰基反應特性的氯甲基取代物，后者能與細胞內含巰基的肽和蛋白結合，使得CM-DiI能夠抵抗醛類的固定作用。CM-DiI在細胞固定、破膜及石蠟包埋的整個過程中均能很好的保留在細胞內，因此，與傳統細胞膜探針DiI相比較，更適于固定后標本的長期示蹤。其紅色/綠色的光譜特征，使其可與綠色探針或者綠色熒光蛋白如GFP一起用于雙標實驗。

Cell-Tracker CM-DiI具以下特征：a）使用方便，只需吸掉培養液，加入探針，30min孵育，顯微成像；b）熒光信號至少可持續72h以上（一般3-6代），染料只傳到子代細胞，不會染上鄰近細胞。c）毒性很低，不會影響細胞增殖和活力。總而言之，Cell-Tracker CM-DiI具有良好的示蹤特征，對細胞無毒，穩定長效，染料很好保留在細胞內，生理pH熒光信號強。

研究證實，CM-DiI標記后熒光在胞內表達穩定，陽性標記率達98%以上，標記細胞形態良好，能有效地觀察細胞在體外的誘導分化情況；或將標記的細胞注入體內，可以有效的顯示移植細胞在活體組織中的遷移及分化。 

細胞膜探針光譜和檢測濾片：1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiA濾光器的選擇參見下表：

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D. DiIC18(3)-DS/DiIC18(5)-DS（磺酸化的碳菁類染料）

由于弱水溶性，通常很難加載長鏈碳菁類染料比如DiI、DiO和PKH到懸浮細胞內。為了應對此處難題，我司開發出磺酸化的碳菁類染料（Sulfonated Carbocyanines）-DiIC18(3)-DS和DiIC18(5)-DS，在維持DiI和DiD的18碳親脂鏈的基礎上，改善其在細胞培養基內的水溶性。只需簡單的將這些染料的DMSO儲存液稀釋到原培養基內（工作濃度范圍1~10uM）即可完成探針的加載。活細胞對陰離子碳菁類染料的吸收速率明顯慢于陽離子碳菁類染料，得到的染色結果可能差異較大。

某些應用要求經過以醛類為媒介的固定和脂質提取后膜染料還能保留在原位。與DiO、DiD或PKH染料標記相比，某些磺酸化的碳菁類染料似乎與標準醛類為基礎的固定方法和丙酮處理兼容，至少在某些細胞系內。

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應用文獻：

1.  Hemmrich Ket al,Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering.Cells Tissues Organs. 2006; 184(3-4):117-27.

2.  Andrade W, et al, The use of the lipophilic fluorochrome CM-DiI for tracking the migration of lymphocytes.J Immunol Methods. 1996 Aug 14;194(2):181-9.

3.  Schatteman GC, et al,Blood-derived angioblasts accelerate blood-flow restoration in diabetic mice.J Clin Invest. 2000 Aug; 106(4):571-8.

4.  Foley-Comer AJ, et al, Evidence for incorporation of free-floating mesothelial cells as a mechanism of serosal healing.J Cell Sci. 2002 Apr 1;115(Pt 7):1383-9.

5.  Djouad F, et al,Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals.Blood. 2003 Nov 15;102(10):3837-44. Epub 2003 Jul 24.

6.  Hosie KA, et al,Chronic excitotoxin-induced axon degeneration in a compartmented neuronal culture model.ASN Neuro. 2012 Feb 23;4(1). pii: e00076. doi: 10.1042/AN20110031.

注意事項：

1.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。