Mag-Fura-2 AM, Cell Permeant 鎂離子熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養(yǎng)級（貨號：NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。

產(chǎn)品簡介：

Mag-Fura-2 AM是一種胞內(nèi)鎂離子指示劑，屬于紫外激發(fā)的比率型探針，與鎂離子結(jié)合的Kd值為1.9mM。與Fura-2類似，Mag-Fura-2的激發(fā)波長歷經(jīng)藍色遷移從369nm到330nm。Mag-Fura-2 AM具細胞膜滲透性，只需簡單孵育，即可加載進入細胞。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO.：130100-20-8

2） 化學名：5-Oxazolecarboxylic acid, 2-[5-[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethoxy]-6-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy] -2-oxoethyl]amino]-2-benzofuranyl]-(acetyloxy)methyl ester

3） 同義名：Furaptra, AM ester

4） 分子式：C30H30N2O19

5） 分子量：722.56g/mol

6） 外觀：黃色固體

7） 純度：≥90%

8） Ex/Em：336/503 nm

9） 溶解性：溶于DMSO

10）化學結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20oC干燥避光保存，至少一年有效。

產(chǎn)品使用：

1.儲存液制備

取一管低溫保存的Mag-Fura-2 AM,，置于室溫回溫至少20min。之后加入高質(zhì)量無水DMSO配制成1~5mM儲存液，比如50μg Mag-Fura-2 AM（MW：722.56 g/mol）溶于13.8μl DMSO，充分溶解后，即得到5mM儲存液。【注意】未使用的儲存液分裝儲存在-20℃，避免反復凍融，且要避光保存。盡快使用完。

2.操作步驟

【注意】以下使用方法僅作參考，需根據(jù)具體的細胞類型和實驗要求做出調(diào)整。加載溫度范圍是RT~37℃，更高溫度會提高加載速度，但更低溫度能最小化染料的內(nèi)在化現(xiàn)象。表面活性劑Pluronic?F-127有時加入能促進AM探針在水溶性緩沖液內(nèi)的均勻分散。

2.1 在所需溫度（25℃~37℃）預孵育細胞10min，使其離子梯度達到穩(wěn)定和平衡。

2.2 取4μl Mag-Fura-2 AM儲存液和5μl 20% Pluronic?F-127，加入1ml細胞培養(yǎng)液，劇烈漩渦混勻得到均勻的探針分散液。

2.3 取250μl上述制備的探針分散液加入750μl含細胞的培養(yǎng)基內(nèi)，混勻，此時得到終濃度為1~5μM的工作液，根據(jù)起始母液濃度來確定。

2.4 根據(jù)需求探針孵育15~60min。

2.5 細胞清洗3次，之后繼續(xù)孵育30min以保證細胞內(nèi)的探針完全去酯化。之后選擇合適的儀器，進行熒光測定。

3.響應(yīng)校正

鎂離子指示劑的校正方法基本與鈣離子指示劑類似。需注意校正是在所有指示劑都已去酯化且都與離子結(jié)合的假設(shè)上進行。校正包括完全不含離子和離子完全飽和相對于外部控制鎂離子濃度的熒光測定。胞內(nèi)校正可能以兩種方式進行，要么通過去污劑裂解細胞（通常使用地高辛）將胞內(nèi)指示劑釋放進入周圍溶液，要么通過一種離子載體來控制胞內(nèi)鎂離子，不用釋放指示劑到周圍溶液。比率型指示劑比如Mag-Fura-2也可能在無細胞溶液內(nèi)進行校正，雖然偏好選擇原位校正，由于指示劑對鎂離子的親和性依賴于胞漿環(huán)境。相對于離子霉素（貨號：NBS7634-1mg），鎂離子校正時傾向選擇離子載體A-23187（貨號：NBS7632-1mg）和4-bromo-A23187（貨號：NBS7633-1mg），由于前者能更有效的轉(zhuǎn)運鎂離子。用來校正鎂離子指示劑的溶液最初需不含重金屬離子比如鎂，否則會與鎂離子指示劑結(jié)合。可通過二價陽離子螯合劑TPEN（貨號：NBS5877-25mg）處理溶液。

3.1 對于具離子依賴性的光譜遷移的指示劑，比如Mag-Fura-2，Kd值（或Mg²⁺濃度，當Kd值已知）能通過以下公式進行換算：

R：代表熒光比值（Fλ1/Fλ2），λ1是離子復合物的檢測波長，λ2是游離指示劑的檢測波長。Min和Max表示最小和最大離子濃度。Q：λ2波長檢測下的Fmin/Fmax的比值。Kd是離子-指示劑復合物的解離常數(shù)。

3.2 對于單波長指示劑比如Mag-Fluo-4，通過以下公式來確定Kd值，F指的是在單波長下測定的熒光強度。

在上述公式中，需注意F值依賴于指示劑濃度，但R值不依賴于指示劑濃度。

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

相關(guān)產(chǎn)品：

應(yīng)用示例（來自文獻，僅用作參考）

文獻一、

使用方法（熒光分光光度計測定[Mg²⁺]m和[Ca²⁺]m）：1）用DMSO配制Mag-fura 2 AM（0.5mM）或Fura 2 AM (0.5mM)儲存液，工作濃度分別是5和10μM。2）線粒體分別加載Mag-fura 2 AM或Fura 2 AM測定游離線粒體內(nèi)的Mg²⁺或Ca²⁺濃度，[Mg²⁺]m和[Ca²⁺]m。25℃，在SH緩沖液內(nèi)分別用Mag-fura 2 AM（5μM）或Fura 2 AM（10μM），和5ul Pluronic F-127孵育線粒體（0.5mg/ml），35min。之后用SH緩沖液清洗線粒體2次以去除多余探針。最后，線粒體再孵育35min使得探針完全水解。之后清洗兩次再開始熒光測定。

通過用熒光分光光度計測定探針加載線粒體的熒光值來確定離子濃度，最大激發(fā)波長分別為340和380nm，發(fā)射波長為509nm。所有的測定在25℃進行，3ml比色皿內(nèi)含2ml線粒體懸浮液（0.5mg 蛋白/ml）。

Fig 1.Original record of an Mg2+ measurement with yeast mitochondria and of the calibration procedure. Mag‐fura 2 emission at a wavelength of 510 nm was measured upon excitation at 380 and 340 nm (standard excitation wavelength for the free mag‐fura 2 and for the ion‐bound mag‐fura 2, respectively). (A) Single wavelength fluorescence intensities of mag‐fura 2‐loaded yeast mitochondria as a function of time and [Mg2+]e. Measurements were started with mag‐fura 2‐loaded mitochondria in essentially Mg2+‐free buffer (see Materials and methods). Mg2+ was added to final concentrations of 1, 5 and 10 mM. [Mg2+]e was raised to 25 mM before the addition of SDS, resulting in Rmax, and the addition of EDTA led to Rmin values. Inset: autofluorescence of mag‐fura 2‐unloaded mitochondria. (B) The 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities shown in Figure 2A. Note that increases in the ratio are caused by an increase in the 340 nm intensity and a decrease in the 380 nm intensity, indicating that changes in the ratio are due in fact to alterations in the ratio of [Mg2+:mag‐fura 2]/[mag‐fura 2]. (C) Effect of an increase of the extramitochondrial [Ca2+] on the 340/380 nm ratio of the fluorescence intensities.