總一氧化氮（NO）檢測試劑盒（顯色法）

Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit

產(chǎn)品簡介：

一氧化氮（Nitric Oxide, NO）是一種活性基，在許多關(guān)鍵生理功能中發(fā)揮重要作用。一氧化氮，一氧化氮合酶（NOS）催化精氨酸的氧化產(chǎn)物，參與宿主防御和發(fā)育、調(diào)節(jié)蛋白活化、以及與功能生物分子之間的直接共價相互作用。一氧化氮生成后迅速代謝生成亞硝酸鹽（Nitrite）和硝酸鹽（Nitrate），兩種首要的、穩(wěn)定的和非揮發(fā)性的裂解產(chǎn)物，通過對這兩種產(chǎn)物的測定能間接反映樣本內(nèi)的一氧化氮水平。

本總一氧化氮檢測試劑盒（Total Nitric Oxide Colorimetric Assay Kit）利用兩步法測定總一氧化氮水平，第一步先用硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，第二步再用經(jīng)典的Griess reagent，對亞硝酸鹽進(jìn)行定量測定，從而推算出總一氧化氮含量。

由于本試劑盒使用的是NADPH依賴的硝酸鹽還原酶，高濃度的NADPH會干擾后續(xù)檢測，因此，試劑盒使用乳酸脫氫酶（LDH）來清除NADPH，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試劑盒以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)品，通過優(yōu)化的檢測體系，檢測下限達(dá)2μM，且在2~80μM范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本試劑盒不僅能檢測細(xì)胞、組織或培養(yǎng)液中的一氧化氮含量，還能檢測血清、血漿或尿液中的一氧化氮含量。

保存條件: 

-20℃保存，一年穩(wěn)定。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

【注意】本試劑盒可用于培養(yǎng)液中的一氧化氮測定，培養(yǎng)液內(nèi)的酚紅和10%血清對測定無明顯干擾。

【注意】樣品中存在的一些內(nèi)在成分可能會干擾測定，導(dǎo)致OD值和靈敏度降低。干擾程度依次順序：尿液>血清>血漿>培養(yǎng)基。

一、 需要設(shè)備

96孔酶標(biāo)儀，最佳波長540nm，或在520~560nm下測定，靈敏度可能會降低。

二、 準(zhǔn)備步驟

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備：

每次測量均新做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用待測樣品所用溶液來稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使得濃度在2~80μM內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)品的濃度通常可取2，5，10，20，40，60，80μM。

比如：當(dāng)樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液上清，細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM+10% FBS，則用DMEM+10% FBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；當(dāng)樣品為血清，可使用本試劑盒內(nèi)提供的樣品稀釋液（NBS5940-A），或簡單使用PBS、生理鹽水等適當(dāng)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；當(dāng)樣品是用一氧化氮分析用裂解液得到的裂解液，則用此裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 樣品準(zhǔn)備：

a）對于含高濃度蛋白的樣品如血清，或含高濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入Griess reagent I后可能產(chǎn)生沉淀，可取50μl樣品，加入50μl Griess reagent I進(jìn)行測試，觀察是否產(chǎn)生沉淀。如有沉淀，則把樣品沸水浴加熱5min以變性蛋白，之后12,000離心5min，取上清用于后續(xù)的測定。

b）當(dāng)樣品為組織或細(xì)胞，可快速凍融裂解，然后離心沉淀取上清，體積不足50μl，可用雙蒸水、超純水或0.9% NaCl稀釋（相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品也需用雙蒸水、超純水或0.9% NaCl稀釋）。細(xì)胞或組織也可用一氧化氮分析用裂解液來裂解，同樣的，標(biāo)準(zhǔn)品需用此裂解液稀釋。

c）當(dāng)樣品為尿液，通常需用水稀釋10~50倍后檢測。

d）當(dāng)樣品為血漿，不宜用肝素抗凝的血漿，因其會和Griess reagent反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。

2.3 試劑準(zhǔn)備

a）加1ml雙蒸水或超純水至5mg NADPH中，顛倒混勻使其充分溶解，之后再加3ml雙蒸水或超純水定容至3ml，配制成2mM NADPH，多余部分按照單次用量分裝，立即置于-70℃保存。

b）FAD第一次使用可適當(dāng)分裝后放在-20℃或-70℃保存。

c）硝酸還原酶和LDH臨用前取出，放置在冰浴上使用，使用完畢后需立即放回-20℃保存。

d）試劑盒內(nèi)的其余各種試劑溶解后保存在冰浴上。

e）Griess reagent I和Griess reagent II使用前需回溫至室溫。

三、測定步驟

3.1參考下表依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和檢測試劑，并進(jìn)行相應(yīng)檢測：

【注意事項】

a） 反應(yīng)必須避光進(jìn)行。當(dāng)使用96孔板進(jìn)行檢測，可用鋁箔紙包裹96孔板進(jìn)行避光。

b） 樣品的用量上限為60μl。血清、血漿或組織勻漿液通常使用40μl足夠。樣品不足60μl，不同樣品之間的體積需要保持一致，體積不足的部分用制備或稀釋樣品所用的溶液補(bǔ)足。

c） 可同時設(shè)置加入200μl水或PBS的2~3個孔為陰性對照，這2~3個孔僅加入水或PBS，不在加入任何其他試劑。

d） 加入Griess reagent I后需輕輕混勻。

e） 每次混勻后，可以1000~3000g離心數(shù)秒，把液體沉淀至管底。同時需避免各檢測孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測結(jié)果。

3.2 在540nm（或520~560nm）測定吸光度。需在30min內(nèi)測完，以防褪色降低靈敏度。

3.3 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得橫縱坐標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系式。之后將樣品OD值代入公式來計總算一氧化氮濃度。

3.4 實(shí)際測定時，由于反應(yīng)條件、試劑盒批次差異等因素，會導(dǎo)致檢測結(jié)果與示例數(shù)據(jù)存在一定差異。

注意事項：

1.      當(dāng)檢測細(xì)胞或組織一氧化氮含量，不建議使用RIPA裂解液，因其可能在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生沉淀，影響測試。建議使用一氧化氮分析用裂解液（不含蛋白酶/磷酸酶抑制劑）。也可自行選擇適當(dāng)方式制備組織或細(xì)胞樣品的裂解液，要考慮到自行選擇的方式是否存在干擾試劑盒內(nèi)酶反應(yīng)的可能。

2.      當(dāng)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)一氧化氮含量，不可使用RPMI1640等含較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液，否則會干擾檢測。

3.      所有檢測反應(yīng)需避光進(jìn)行。

4.      由于檢測過程存在還原反應(yīng)，凡是影響還原反應(yīng)的試劑都需要避免，比如DTT或2-ME。

5.      本試劑盒利用的是間接法測定總一氧化氮含量，如果只需粗略測定一氧化氮相對量，可選擇我司提供的一氧化氮檢測試劑盒（貨號：NBS5939-500T）。如果需要直接測定一氧化氮水平，比如測定細(xì)胞內(nèi)實(shí)際的一氧化氮水平，可選擇我司提供的DAF-FM DA一氧化氮熒光探針（貨號：NBS5935-100T）。

6.      本試劑盒對人體有害，請注意適當(dāng)防護(hù)，避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

7.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

常見問題：

1. 檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線良好，但樣品的吸光度很低，和空白對照接近，什么原因？

回復(fù)：標(biāo)準(zhǔn)曲線良好說明檢測方法和檢測試劑盒基本上沒有問題，樣品吸光度低說明樣品中一氧化氮含量很低。可以采取的辦法是：1）加大樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的使用量至60μl，其余試劑用量不變。2）把整個檢測體系每種試劑的用量加大50%，這樣可以使檢測靈敏度增加約50%。3）如果上述方法還不能解決問題，可以考慮濃縮樣品，即一方面在收集樣品的時候盡量使一氧化氮的濃度保持得較高（例如裂解細(xì)胞時采用較小體積的裂解液），另一方面可以考慮用真空干燥或真空冷凍干燥的方法濃縮樣品。

2. 檢測時發(fā)現(xiàn)每個樣品的吸光度都非常高，什么情況？

回復(fù)：使用RPMI 1640培養(yǎng)液時會發(fā)生這種情況。因RPMI 1640培養(yǎng)液中含有高濃度的硝酸鹽從而會使樣品檢測出來的吸光度都非常高。其他含有高濃度硝酸鹽的試劑也會產(chǎn)生類似情況，影響氧化還原反應(yīng)的試劑也可能產(chǎn)生類似干擾。使用過程中避免使用RPMI 1640等可能導(dǎo)致干擾檢測的試劑即可。

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