CFDA SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒

CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit 

產(chǎn)品簡介：

CFDA SE細(xì)胞增殖與示蹤檢測試劑盒（CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit）是一款基于熒光探針CFDA, SE，用于細(xì)胞增殖檢測和細(xì)胞熒光示蹤的檢測試劑盒。此方法目前廣泛替代MTT法或者3H-胸腺嘧啶核苷摻入法（3H-thymidine incorporation）等細(xì)胞增殖檢測方法。本試劑盒包含粉末形式的CFDA, SE探針，細(xì)胞培養(yǎng)級的溶劑，以及細(xì)胞標(biāo)記液，使用方便，操作簡單。按照每個樣本的標(biāo)記體積為1ml來算，我司提供兩種規(guī)格的試劑盒，分別可檢測500個和1000個樣品。

CFDA, SE，英文全名5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CAS NO. 150347-59-4，是一種穩(wěn)定的、細(xì)胞膜滲透性的非熒光染料，由兩個醋酸基團(tuán)和一個琥珀酰亞胺酯（SE）官能團(tuán)組成的一個熒光分子。一旦主動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，其醋酸基團(tuán)被胞內(nèi)酯酶切割，生成熒光素酯CFSE。CFSE具有高度熒光，且能通過其琥珀酰亞胺酯基團(tuán)共價結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的蛋白氨基基團(tuán)。正是這個共價偶聯(lián)反應(yīng)，CFSE能夠極其長期的保留在細(xì)胞內(nèi)，長達(dá)數(shù)個月。另外，歸因于這一穩(wěn)定連接，一旦染料進(jìn)入細(xì)胞，不會轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞。無活力細(xì)胞仍然是非熒光。而活細(xì)胞一旦分化，CFSE能夠很均勻的分散到子細(xì)胞中，每分裂一次子代細(xì)胞約能得到親本細(xì)胞1/2的熒光強(qiáng)度，因此，通過流式細(xì)胞儀對熒光強(qiáng)度的檢測，能夠依次分選出未分裂細(xì)胞，分裂一次的細(xì)胞（1/2熒光強(qiáng)度），分裂兩次的細(xì)胞（1/4熒光強(qiáng)度），分裂三次的細(xì)胞（1/8熒光強(qiáng)度），以及以此類推其他分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSE可以檢測分裂多達(dá)8次或更多次數(shù)的細(xì)胞增殖。

CFSE廣泛用于細(xì)胞增殖和體內(nèi)細(xì)胞示蹤研究。CFSE的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為492nm和517nm，標(biāo)記細(xì)胞后呈綠色熒光。使用流式細(xì)胞儀檢測可用FL1檢測通道。也能用熒光顯微鏡觀察，使用FITC濾片。

保存條件: 

-20oC保存，開封前1年有效，其中組分A（CFDA SE粉末）需嚴(yán)格避光，組分B避免強(qiáng)光照射。

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品使用：

1. CFDA SE儲存液（1000X）制備

a）將低溫保存的CFDA SE粉末置于室溫回溫至少20min，之后短暫低速離心，讓所有粉末都掉落至管底。同時也提前將CFDA SE溶劑置于室溫或25℃水浴片刻直至充分融解。

b）吸取一定量CFDA SE溶劑（比如400μl）到CFDA SE粉末中，充分溶解，短暫低速離心，之后全部轉(zhuǎn)移到剩下的CFDA SE溶劑中，混勻后，此即為CFDA SE儲存液（1000X）。此配制過程需要避光。

c）按照單次用量分裝，用鋁箔紙包好后，置于≤-20℃避光干燥保存，最好一個月內(nèi)用完，最長不超過三個月。-70℃保存能適當(dāng)延長保存周期。

2. CFDA SE標(biāo)記液（1X）制備

準(zhǔn)備適量無菌的細(xì)胞培養(yǎng)級去離子水，根據(jù)實驗需要用量，配制適量的CFDA SE標(biāo)記液（1X）。比如，取10ml 細(xì)胞標(biāo)記液（10X），加入90ml 去離子水，充分混勻后，即得到CFDA SE標(biāo)記液（1X），短期置于4℃保存，長期不用可置于-20℃保存。

3. 染色步驟

a）室溫300×g離心細(xì)胞5min，吸掉上清。

b）PBS或其他生理緩沖液清洗細(xì)胞以去除任何殘留的血清蛋白。之后再同上離心吸掉上清。

c）用1ml CFDA SE標(biāo)記液（1X）重懸細(xì)胞，調(diào)整密度為1-5 x 10⁶cells/mL，轉(zhuǎn)移到15ml離心管內(nèi)。

d）用CFDA SE標(biāo)記液（1X）將CFDA SE儲存液（1000X）稀釋到2X。比如，取2μl CFDA SE儲存液（1000X）到1ml CFDA SE標(biāo)記液（1X），混勻后即為CFDA SE儲存液（2X）。

e）將1ml CFDA SE儲存液（2X）加入到步驟c）中含1ml 待標(biāo)記細(xì)胞的15ml離心管內(nèi)，輕輕混勻。

f）37℃避光孵育15min。【具體的孵育時間可根據(jù)實際情況做適當(dāng)調(diào)整，常用孵育時間10-30min。】

g）立即加入10ml完全細(xì)胞培養(yǎng)液（含血清）來淬滅染色過程，室溫顛倒幾次混勻。

h）室溫離心去上清，再用5-10ml完全細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一次。

i） 再加入5-10ml完全細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃孵育5min，以促進(jìn)CFDA, SE在細(xì)胞內(nèi)的充分反應(yīng)和未反應(yīng)的CFDA, SE重新回到完全細(xì)胞培養(yǎng)液中。離心去上清，完成最后一次清洗。

j） 之后用完全細(xì)胞液重懸細(xì)胞，此時可用熒光顯微鏡（Ex/Em=492/517nm，F(xiàn)ITC濾片）或流式細(xì)胞儀（FL1通道）來觀察標(biāo)記效果。或開始用藥物刺激處理或繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)適當(dāng)時間后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖，或用于特定目的的細(xì)胞示蹤。標(biāo)記細(xì)胞也可用于活體動物的移植，并用熒光進(jìn)行示蹤。標(biāo)記的細(xì)胞呈綠色熒光。

注意事項：

1.      CFDA SE溶劑在低溫（如4℃，冰浴）等條件下會凝固而粘在離心管底、管壁或蓋子上，可將其置于25℃溫育片刻直至全部融解后使用。

2.      CFDA SE粉末經(jīng)溶劑溶劑配制成儲存液后一個月內(nèi)用完最好，最多不超過三個月。因CFDA SE容易被水解，并在水溶液中變質(zhì)。使用過程中盡量避免接觸水。而在標(biāo)記過程中接觸到水是在允許范圍內(nèi)。

3.      熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

4.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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