CFDA, SE 細(xì)胞增殖示蹤熒光探針

產(chǎn)品簡介：

CFDA, SE，英文全名5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester，CAS NO. 150347-59-4，是一種穩(wěn)定的、細(xì)胞膜滲透性的非熒光染料，由兩個(gè)醋酸基團(tuán)和一個(gè)琥珀酰亞胺酯（SE）官能團(tuán)組成的一個(gè)熒光分子。一旦主動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，其醋酸基團(tuán)被胞內(nèi)酯酶切割，生成熒光素酯CFSE。CFSE具有高度熒光，且能通過其琥珀酰亞胺酯基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的蛋白氨基基團(tuán)。正是這個(gè)共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)，CFSE能夠極其長期的保留在細(xì)胞內(nèi)，長達(dá)數(shù)個(gè)月。另外，歸因于這一穩(wěn)定連接，一旦染料進(jìn)入細(xì)胞，不會(huì)轉(zhuǎn)移到鄰近細(xì)胞。無活力細(xì)胞仍然是非熒光。而活細(xì)胞一旦分化，CFSE能夠很均勻的分散到子細(xì)胞中，每分裂一次子代細(xì)胞約能得到親本細(xì)胞1/2的熒光強(qiáng)度，因此，通過流式細(xì)胞儀對(duì)熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，能夠依次分選出未分裂細(xì)胞，分裂一次的細(xì)胞（1/2熒光強(qiáng)度），分裂兩次的細(xì)胞（1/4熒光強(qiáng)度），分裂三次的細(xì)胞（1/8熒光強(qiáng)度），以及以此類推其他分裂次數(shù)的細(xì)胞。CFSE可以檢測(cè)分裂多達(dá)8次或更多次數(shù)的細(xì)胞增殖。

CFSE廣泛用于細(xì)胞增殖和體內(nèi)細(xì)胞示蹤研究。CFSE的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為492nm和517nm，標(biāo)記細(xì)胞后呈綠色熒光。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)可用FL1檢測(cè)通道。也能用熒光顯微鏡觀察，使用FITC濾片。

產(chǎn)品特性：

1） CAS NO.：150347-59-4

2） 化學(xué)名：3',6'-bis(acetyloxy)-3-oxo-2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl ester-spiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthene] -ar-carboxylic acid

3） 同義名：5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester, 5(6)-CFDA N-succinmidyl ester, CFDA-SE

4） 分子式：C29H19NO11

5） 分子量：557.46

6） 純度：≥94%（HPLC）

7） Ex/Em：492/517nm

8） 外觀：近乎白色至黃色粉末或結(jié)晶

9） 溶解性：溶于DMSO，DMF

10）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20oC避光干燥保存，至少2年有效。

產(chǎn)品使用：

1. 儲(chǔ)存液制備

將低溫保存的凍干粉產(chǎn)品置于室溫回溫至少20min，之后短暫低速離心，讓所有粉末都掉落至管底。稱取適量粉末用高質(zhì)量無水DMSO溶解配制10mM儲(chǔ)存液。比如5mg CFDA, SE（Mw: 557.46）用897μl DMSO充分溶解即得到10mM儲(chǔ)存液。根據(jù)單次用量分裝，置于≤-20℃避光干燥保存，避免反復(fù)凍融。儲(chǔ)存液最好是一個(gè)月內(nèi)用完，最多不超過三個(gè)月。

2. 工作液制備

于正式實(shí)驗(yàn)前，用HHBS緩沖液或其他生理緩沖液（pH 7.0）稀釋儲(chǔ)存液到1-10μM工作濃度，渦旋混勻。

【注意事項(xiàng)】：

1） CFDA, SE是胺反應(yīng)性。CFDA, SE標(biāo)記步驟不可使用含首胺的緩沖液，比如，HHBS或PBS是推薦的CFDA, SE稀釋緩沖液。

2） CFDA, SE的染色濃度需要根據(jù)使用的細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩磉M(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。比如，如果用于細(xì)胞增殖的熒光逐漸稀釋分析，相對(duì)高濃度的CFDA, SE染色工作液比較理想；如果僅是用來標(biāo)記細(xì)胞用作另外一種熒光標(biāo)志探針的復(fù)染劑，相對(duì)低濃度的CFDA, SE染色工作液比較理想，能夠良好的防止不同濾片設(shè)置間的熒光溢出。

3. 染色步驟

此染色步驟僅做指導(dǎo)，具體實(shí)驗(yàn)步驟可根據(jù)實(shí)際情況來做適當(dāng)調(diào)整。

3.1 室溫300×g離心細(xì)胞5min，吸掉上清。

3.2 用預(yù)熱的無菌HHBS，PBS或其他生理緩沖液清洗細(xì)胞以去除任何殘留的血清蛋白。之后同上離心細(xì)胞，吸掉上清。

3.3 用上述配制好的CFDA, SE染色工作液重新懸浮細(xì)胞，制備成1-3 x 10⁷cells/mL的單細(xì)胞懸液。

3.4 室溫或37℃避光孵育15~30min。中間可偶爾的輕輕顛倒混勻使得細(xì)胞均勻接觸到染料。

3.5 加入5倍原始染色體積的細(xì)胞培養(yǎng)液（含10% FBS）來淬滅染色過程，輕輕顛倒幾次混勻。

3.6 室溫300×g離心細(xì)胞5min，吸掉上清。再用10ml完全細(xì)胞培養(yǎng)液清洗細(xì)胞一次。

3.7 再用10ml完全細(xì)胞培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，37℃孵育5min，以促進(jìn)CFDA, SE在細(xì)胞內(nèi)的充分反應(yīng)和未反應(yīng)的CFDA, SE重新回到完全細(xì)胞培養(yǎng)液中。離心去上清，完成最后一次清洗。

3.8 之后用完全細(xì)胞液重懸細(xì)胞，此時(shí)可用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀來觀察標(biāo)記效果。或開始用藥物刺激處理或繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)適當(dāng)時(shí)間后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖，或用于特定目的的細(xì)胞示蹤。標(biāo)記細(xì)胞也可用于活體動(dòng)物的移植，并用熒光進(jìn)行示蹤。

注意事項(xiàng)：

1.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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