CM-H2DCFDA 活性氧（ROS）熒光探針

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

CM-H₂DCFDA，英文全名：5-(and 6-)chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester，中文全名：5-(and 6-)氯甲基-2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯，是一種通用的氧化應(yīng)激指示劑，是H₂DCFDA（DCFH-DA，貨號(hào)：NBS6702）的氯甲基衍生物，在活細(xì)胞中表現(xiàn)出更好的滯留率。CM-H₂DCFDA具細(xì)胞膜滲透性，主動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入胞內(nèi)，其乙酸酯基團(tuán)被細(xì)胞內(nèi)酯酶切割，其硫醇反應(yīng)性的氯甲基基團(tuán)與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽和其他硫醇發(fā)生反應(yīng)。后續(xù)氧化產(chǎn)生熒光加合物被捕獲在細(xì)胞內(nèi)，從而有助于長(zhǎng)期研究。通過流式細(xì)胞儀、熒光計(jì)、熒光酶標(biāo)板或熒光顯微鏡（配有適用于熒光素的激發(fā)光源和濾光片）對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

本品以粉末形式提供，可直接溶于無水DMSO配制成1-10mM儲(chǔ)存液，常用工作濃度1-10μM，需根據(jù)自身的實(shí)驗(yàn)體系或參考文獻(xiàn)進(jìn)行優(yōu)化。

產(chǎn)品特性：

1） 同義名：5-(and 6-)chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester; 5-(and 6-)氯甲基-2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸乙酰酯；

2） 分子式：C₂₇H₁₉Cl₃O₈

3） 分子量：577.8

4） 純度：≥90%

5） 外觀：粉末

6） 激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)：~492–495/517–527 nm

7） 溶解性：溶于DMSO、DMF、無水乙醇

8）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20oC避光干燥保存，至少1年有效。 

產(chǎn)品使用：（僅作參考）

以下步驟是來源于大量文獻(xiàn)總結(jié)的簡(jiǎn)易操作流程，僅作參考。用戶需根據(jù)特定的應(yīng)用和敏感性來做調(diào)整。

1） 將低溫保存的凍干粉取出回至室溫，低速離心使粉末落到瓶底。之后加入適量無水DMSO或其他有機(jī)溶劑配制成1-10mM儲(chǔ)存液。未用完的DMSO儲(chǔ)存液需分裝并避光凍存在≤-20℃，避免反復(fù)凍融。

2） 于正式實(shí)驗(yàn)前，用生理鹽緩沖液（比如：PBS，HBSS，HEPES）稀釋到工作濃度1-10μM。需根據(jù)具體應(yīng)用來調(diào)整合適的工作濃度。

3） 吸走培養(yǎng)液，加入步驟2）配制的染色工作液到細(xì)胞內(nèi)，室溫或30℃孵育5~60min。

4） 吸走染色工作液，用預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液清洗一遍。重新加入預(yù)熱的生理緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液，在適宜溫度內(nèi)孵育。對(duì)于二乙酸酯衍生物，需要短暫復(fù)原時(shí)間讓細(xì)胞內(nèi)酯酶將其水解，從而讓染料對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)。最佳的復(fù)原時(shí)間范圍很廣，由于某些細(xì)胞類型通常顯示極其低水平的酯酶活性。

5） 將細(xì)胞暴露于實(shí)驗(yàn)刺激物之前，先測(cè)定加載細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度。

6） 根據(jù)以下情況評(píng)估陰性對(duì)照（Negative control），

6.1 綠色發(fā)射光譜內(nèi)檢查未染色細(xì)胞的自熒光情況。

6.2 對(duì)于流式分析，查明染料加載和處理后細(xì)胞的前向角散射和側(cè)向角散射是不變。細(xì)胞尺寸的變化可能與起泡或萎縮有關(guān)，由于處理或有毒反應(yīng)引起的。

6.3 對(duì)包含和不包含刺激物的染料和緩沖液/培養(yǎng)基的無細(xì)胞混合物進(jìn)行熒光檢測(cè)。在不含細(xì)胞外酯酶和其他氧化酶的情況下，隨著時(shí)間熒光的逐漸增加可能與瞬間水解、空氣氧化、和/或光誘導(dǎo)氧化有關(guān)。

6.4 檢查培養(yǎng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)液或簡(jiǎn)單緩沖液內(nèi)的未處理加載細(xì)胞（對(duì)照）的熒光。在健康細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酶和/或天然抗氧化劑會(huì)清除這些氧自由基。經(jīng)過染料加載復(fù)原時(shí)間后，健康細(xì)胞應(yīng)該表現(xiàn)出低水平的熒光信號(hào)，且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間相對(duì)穩(wěn)定。然而，逐漸增加（由于自氧化）或降低（由于細(xì)胞內(nèi)染料喪失或光淬滅）也有可能觀察到。在不含任何刺激物或誘導(dǎo)劑的體系內(nèi)，健康和未處理細(xì)胞突然發(fā)現(xiàn)強(qiáng)熒光，表明細(xì)胞發(fā)生死亡或一些其他的氧化事件。

7） 建立陽性對(duì)照（Positive control），可能用以下方法刺激氧化活性：

① 腫瘤促進(jìn)劑（PMA，工作濃度100pM~10μM）

② 細(xì)菌趨化肽（fMLP，工作濃度1~10μM）

    ③ H₂O₂或TBHP（終濃度~100μM）（根據(jù)細(xì)胞本身對(duì)其的靈敏度和反應(yīng)性來提高或降低濃度）

8） 確保刺激藥物或化合物不會(huì)引起染料熒光淬滅。檢查化合物的吸收光譜，確定化合物的吸收峰不會(huì)與氧化后染料的最大激發(fā)或發(fā)射光譜發(fā)生重疊。

注意事項(xiàng)：

1.      有機(jī)溶劑如DMSO儲(chǔ)存液需分裝成單次用量后，-20oC避光保存，避免反復(fù)凍融。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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