Reactive Oxygen Species (ROS) Assay Kit 活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品信息

研究意義：

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。

產(chǎn)品描述：

活性氧檢測(cè)試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit，或ROS Assay Kit）是一種利用熒光染料DCFH-DA（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧水平檢測(cè)的常用方法。檢測(cè)原理在于DCFH-DA本身無(wú)熒光，能自由穿過(guò)細(xì)胞膜，一旦進(jìn)入細(xì)胞后，被胞內(nèi)的酯酶水解生成無(wú)熒光的DCFH。DCFH不能穿透細(xì)胞膜，從而保留在胞內(nèi)。此時(shí)胞內(nèi)的活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF。通過(guò)DCF熒光的強(qiáng)弱即可反映活性氧的水平。

本試劑盒包含活性氧陽(yáng)性對(duì)照Rosup，利于活性氧的檢測(cè)。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/ml。因檢測(cè)對(duì)象和反應(yīng)體系的不同，本試劑盒可檢測(cè)100-500個(gè)樣品。

產(chǎn)品組成：

保存與運(yùn)輸方法：

保存：-20oC保存，有效期一年。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

使用方法

1. 裝載探針

【注意】：對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常2h以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照Rosup和/或待研究藥物刺激細(xì)胞；對(duì)于刺激時(shí)間較長(zhǎng)（通常6h以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照Rosup或待研究藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

1.1 原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

1）檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板，確保活性氧檢測(cè)當(dāng)天細(xì)胞匯合率達(dá)到50~70%。

2）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適量體積以及濃度的待研究藥物，于37oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型和藥物自身特性決定。

【可選】陽(yáng)性對(duì)照Rosup：先用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽(yáng)性對(duì)照，通常37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異【刺激時(shí)間可參考文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)經(jīng)驗(yàn)來(lái)調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當(dāng)提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過(guò)快，則適當(dāng)降低Rosup的工作濃度。

3）按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積DCFH-DA工作液。【注意】：加入體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜。對(duì)于6孔板，每個(gè)孔加入DCFH-DA工作液不少于1ml。對(duì)于96孔板，每個(gè)孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1ml。

4）37oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。

5）用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

1.2 收集細(xì)胞后裝載探針

1）按照常規(guī)方法，清洗并收集足量的細(xì)胞。【注意】：保證細(xì)胞的狀態(tài)健康。

2）用適量體積以及濃度的待研究藥物重新懸浮細(xì)胞，于37oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型和藥物自身特性決定。【可選】陽(yáng)性對(duì)照Rosup：先用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1:1000比例稀釋陽(yáng)性對(duì)照，通常37℃培養(yǎng)箱內(nèi)刺激20~30min可以觀察到顯著的活性氧水平提高，但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異【刺激時(shí)間可參考文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)經(jīng)驗(yàn)來(lái)調(diào)整】。如果刺激后30min內(nèi)未觀察到活性氧水平升高，可以適當(dāng)提高Rosup的工作濃度；反之，如果活性氧升高過(guò)快，則適當(dāng)降低Rosup的工作濃度。

3）探針裝載前，按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（10mM），使其終濃度為10μM.。

4）離心，吸出細(xì)胞內(nèi)刺激藥物，之后用適量DCFH-DA工作液重懸細(xì)胞，使得細(xì)胞密度為1×106~2×107/ml。【注意】：細(xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)檢測(cè)體系，檢測(cè)方法，以及檢測(cè)總量來(lái)調(diào)整。例如，對(duì)于流式分析，單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目控制在104~ 106之間。

5）37oC細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min。每隔3~5min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。

6）用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。

2. 檢測(cè)

2.1 原位裝載法

可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.2 收集細(xì)胞后裝載法

可用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，也可用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3. 參數(shù)設(shè)置

使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。

4. 其他說(shuō)明

1）對(duì)于某些細(xì)胞，若發(fā)現(xiàn)沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000～1:5000稀釋DCFH-DA，使DCFH-DA的工作濃度為2～5μM。探針裝載時(shí)間也可依情況在15～60min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。

2）Rosup僅僅用于作為陽(yáng)性對(duì)照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入Rosup陽(yáng)性對(duì)照。

注意事項(xiàng)

1）探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針，否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。

2）探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。

3）盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間（刺激時(shí)間除外），以減少各種可能的誤差。

4）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

附表1 活性氧探針（HPF, APF, DCFH）對(duì)各種活性氧物質(zhì)的反應(yīng)特異性

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