Magneti-G Anti-RFP Beads

產品介紹

1 RFP標簽

紅色熒光蛋白基因是從海葵中分離出的一種紅色熒光蛋白基因，其蛋白質的最大吸收光譜為 583 nm，不需要任何預處理便可檢測到，通過重組 DNA技術將 RFP標簽融合到目的蛋白的 C端或 N端后，可以檢測其融合表達蛋白的表達、定位純化，該系統已廣泛應用于各種細胞類型，包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等。

2 Anti-RFP抗體

Anti-RFP抗體可以用于檢測和RFP標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，也可以用于RFP融合表達蛋白的純化、定性或定量檢測。本公司的Anti-RFP親和力較高，適合做 WB、IP等蛋白互作實驗。

3磁珠性質

高聚物磁珠采用高分子聚合技術將超順磁性材料和高分子材料完美地結合在一起，具有更快的磁響應性同時保持微球良好的分散性、極低的非特異性 吸附和更豐富的結合位點。磁珠具體性能見表 1。

表 1：Magneti-G Anti-RFP Beads產品性能

使用方法

本操作流程主要為蛋白互作實驗，每次反應使用 20 μl Magneti-G Anti-RFP Beads。

1 推薦緩沖液（自備）

表 2 ：緩沖液配置

2 磁珠漂洗

1) 將磁珠充分混勻后取 20ul磁珠置于離心管中，向管中加入 500ul洗雜緩沖液，上下顛倒混勻 5-10次。

2) 將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

3) 向管中加入 500ul洗雜緩沖液，上下顛倒混勻 5-10次，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4) 重復操作 3次。

3 樣品孵育

1）向上述漂洗好的磁珠中加入 500-1000ul的細胞裂解樣品，常溫或 4℃下孵育 60min（建議在旋轉混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）。

2）孵育結束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉移至新的離心管中，留樣備檢。

3）向離心管中加入 500ul洗雜緩沖液，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清。

4）重復操作 5次。

注：孵育溫度和時間范圍推薦為：室溫 0.5 h-2 h或者4℃、1 h-4 h，根據實際的結合效果適當調整孵育時間，一般情況下不建議過夜孵育，過夜孵育 可能會引起過多的非特異性吸附。磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置 3-5分鐘。

4 蛋白洗脫

1) 洗脫液洗脫

每 20ul原始磁珠體積加入 40ul洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻 3-5次。孵育結束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后， 吸取上清至新的離心管中，加入少量的中和緩沖液將 pH調至中性，最后進行 Western檢測。

2) SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫

每 20ul原始磁珠體積加入 60ul的 1×SDS Loading Buffer，輕搖搖晃混勻后 95-100℃高溫處理 5-10min。將離心管置于磁力架上分離 10s，取上清 進行 SDS-PAGE電泳或進行 Western檢測。

注意事項

1) 本產品保存在 2-8℃，不可凍結保存；

2) 本產品出現輕微團聚屬正常現象，可正常使用；

3) 本產品不要使用含有 DTT等還原劑的細胞裂解液樣品，DTT可能會導致抗體配體的脫落；

4) 本產品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會導致抗體配體脫落；

5) 在清洗和洗脫時避免吸取到磁珠，清洗時吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時吸取到磁珠會影響目的蛋白的質量和電泳效果，第一次洗脫后可 以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進行吸附。

參考信息

1）RFP tag IP實驗：樣品為胞內表達蛋白，含有 His和RFP標簽。

2）取 0.5ml懸浮細胞（≈1.5×10?個）常溫下 1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速進行裂解、離心；

3）加入 20 μl已經清洗過的磁珠于離心后的上清中搖晃孵育 30min；

4）將含有磁珠的樣品管轉移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5）用洗雜緩沖液清洗 5次后加入 2×SDS Loading Buffer 99℃高溫處理10min后進行 WB；

6）檢測抗體為 Anti His-HRP mAb，陰性對照(-)為不帶有 RFP抗體的磁珠和樣本孵育。

常見問題與解答

1) 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區別？

a) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100 μm，交聯時會有一部分配體會進入球孔內部，所以偶聯載量相對較高，適用于蛋白的快速純化；而聚合 物磁珠通常粒徑為 1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結合蛋白，空間位阻影響小，適用于蛋白互作實驗，但其載量不高；

b) 推薦使用瓊脂糖磁珠進行蛋白純化實驗，使用聚合物磁珠進行蛋白互作實驗如 IP、Co-IP和 pull down實驗等。

2) 為何結合不到目的蛋白？

a) 可能是由于蛋白無表達造成的，建議在純化前用WB檢測下蛋白原始表達量，如果WB無信號，目的蛋白很難捕獲；

b) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質，建議選用合適的裂解液，或者直接超聲破碎（CO-IP實驗不建議使用超聲破碎）。