Magneti-G Anti-GFP Beads

產(chǎn)品介紹

1 GFP標(biāo)簽

綠色熒光蛋白是一種在美國(guó)西北海岸所盛產(chǎn)的水母中所發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，生存歷史超過(guò) 1.6億年，GFP基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光 線激發(fā)下會(huì)發(fā)出綠色螢光。通過(guò)重組 DNA技術(shù)將 GFP標(biāo)簽融合到目的蛋白的 C端或 N端后，可以檢測(cè)其融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、定位純化，該系統(tǒng) 已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞類(lèi)型，包括細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。

2 Anti-GFP抗體

Anti-GFP抗體可以用于檢測(cè)和 GFP標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，也可以用于 GFP融合表達(dá)蛋白的純化、定性或定量檢測(cè)。本公司的 Anti-GFP親和力較高，適合做WB、IP等蛋白互作實(shí)驗(yàn)。 

3 磁珠性質(zhì)

高聚物磁珠采用高分子聚合技術(shù)將超順磁性材料和高分子材料完美地結(jié)合在一起，具有更快的磁響應(yīng)性同時(shí)保持微球良好的分散性、極低的非特異性 吸附和更豐富的結(jié)合位點(diǎn)。磁珠具體性能見(jiàn)表 1。

表 1：Magneti-G Anti-GFP Beads產(chǎn)品性能

使用方法

本操作流程主要為蛋白互作實(shí)驗(yàn)，每次反應(yīng)使用 20 μl Magneti-G Anti-GFP Beads。

1 推薦緩沖液（自備）

表 2 ：緩沖液配置

2 磁珠漂洗

1）將磁珠充分混勻后取 20ul磁珠置于離心管中，向管中加入 500ul洗雜緩沖液，上下顛倒混勻 5-10次。

2）將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

3）向管中加入 500ul洗雜緩沖液，上下顛倒混勻 5-10次，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4）重復(fù)操作 3次。

3 樣品孵育

1）向上述漂洗好的磁珠中加入 500-1000ul的細(xì)胞裂解樣品，常溫或 4℃下孵育 60min（建議在旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）。

2）孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，留樣備檢。

3）向離心管中加入 500ul洗雜緩沖液，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清。

4）重復(fù)操作 5次。

注：孵育溫度和時(shí)間范圍推薦為：室溫 0.5 h-2 h或者4℃、1h-4h，根據(jù)實(shí)際的結(jié)合效果適當(dāng)調(diào)整孵育時(shí)間，一般情況下不建議過(guò)夜孵育，過(guò)夜孵育 可能會(huì)引起過(guò)多的非特異性吸附。磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置 3-5分鐘。

4 蛋白洗脫

1) 洗脫液洗脫

每 20ul原始磁珠體積加入 40ul洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻 3-5次。孵育結(jié)束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后， 吸取上清至新的離心管中，加入少量的中和緩沖液將 pH調(diào)至中性，最后進(jìn)行 Western檢測(cè)。

2) SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫

每 20ul原始磁珠體積加入 60ul的 1×SDS Loading Buffer，輕搖搖晃混勻后 95-100℃高溫處理 5-10min。將離心管置于磁力架上分離 10s，取上清 進(jìn)行 SDS-PAGE電泳或進(jìn)行 Western檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1) 本產(chǎn)品保存在 2-8℃，不可凍結(jié)保存；

2) 本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團(tuán)聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用；

3) 本產(chǎn)品不要使用含有 DTT等還原劑的細(xì)胞裂解液樣品，DTT可能會(huì)導(dǎo)致抗體配體的脫落；

4) 本產(chǎn)品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會(huì)導(dǎo)致抗體配體脫落；

5) 在清洗和洗脫時(shí)避免吸取到磁珠，清洗時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響最終的載量，洗脫時(shí)吸取到磁珠會(huì)影響目的蛋白的質(zhì)量和電泳效果，第一次洗脫后可 以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進(jìn)行吸附。

參考信息

1) GFPtag IP實(shí)驗(yàn)：樣品為胞內(nèi)表達(dá)蛋白，含有 His和 GFP標(biāo)簽。

2) 取 0.5ml懸浮細(xì)胞（≈1.5×10?個(gè)）常溫下 1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速進(jìn)行裂解、離心；

3) 加入 20 μl已經(jīng)清洗過(guò)的磁珠于離心后的上清中搖晃孵育 30min；

4) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5) 用洗雜緩沖液清洗 5次后加入 1×SDS Loading Buffer99℃高溫處理 10min后進(jìn)行 WB；

6) 檢測(cè)抗體為Anti His-HRP mAb，陰性對(duì)照(-)為不帶有 GFP抗體的磁珠和樣本孵育。

常見(jiàn)問(wèn)題與解答

1) 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區(qū)別？

a) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100 μm，交聯(lián)時(shí)會(huì)有一部分配體會(huì)進(jìn)入球孔內(nèi)部，所以偶聯(lián)載量相對(duì)較高，適用于蛋白的快速純化；而聚合 物磁珠通常粒徑為 1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類(lèi)型的磁珠能夠快速結(jié)合蛋白，空間位阻影響小，適用于蛋白互作實(shí)驗(yàn)，但其載量 不高；

b) 推薦使用瓊脂糖磁珠進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)，使用聚合物磁珠進(jìn)行蛋白互作實(shí)驗(yàn)如 IP、Co-IP和 pull down實(shí)驗(yàn)等。

2) 為何結(jié)合不到目的蛋白？

a) 可能是由于蛋白無(wú)表達(dá)造成的，建議在純化前用 WB檢測(cè)下蛋白原始表達(dá)量，如果 WB無(wú)信號(hào)，目的蛋白很難捕獲；

b) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質(zhì)，建議選用合適的裂解液，或者直接超聲破碎（CO-IP實(shí)驗(yàn)不建議使用超聲破碎）。