硫化氫（H₂S）熒光探針產品專題—WSP-1/WSP-5/AzMC

背景描述

硫化氫（H₂S）是第三大氣體介質，另兩種是一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO），在哺乳動物的免疫學、神經學、心血管和呼吸系統中發揮顯著的生理效應。哺乳動物體內H₂S歸因于至少三種內源性酶：胱硫醚-β-合成酶（Cystathionine-β-synthase，CBS），細胞胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CGL，CSE），3-巰基丙酮酸硫基轉移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST），這些酶在不同的器官和組織內，使用半胱氨酸或半胱氨酸衍生物為底物，并將其轉化為H₂S。

H₂S作為一種高度反應性分子，能夠與大量的生物靶標反應，這些反應涉及到H₂S的各種生理功能。比如，H₂S立即與高鐵血紅蛋白反應生成硫化血紅蛋白，后者可用作H₂S的代謝庫。H₂S是一種強效的還原劑，很可能與內源性氧化劑如過氧亞硝基陰離子，超氧化物和過氧化氫反應。能引起蛋白硫巰基化修飾（-SSH），這是一種重要的蛋白翻譯后修飾，提供一種可能機制使得H₂S改變細胞內大量的蛋白和酶的功能。盡管如此，內源性H₂S的生成以及外源注射H₂S對許多疾病都表現出保護效應，為此，了解H₂S的化學和特征，以及開發一種有效且方便的方法來檢測生物體系內H₂S顯得十分重要。

系列專題一、硫化氫（H₂S）熒光探針（WSP-1/WSP-5）

產品特點

我公司（上海諾寧生物）提供一系列新開發的高效且便捷的硫化氫（H₂S）熒光探針——Washington State Probe（WSP）（WSP-1, WSP-2, WSP-3, WSP-4, WSP-5），這類探針由M. Xian團隊開發并經多方驗證非常適合生物樣本的H₂S檢測。這類探針的特點如下：

1）低背景：探針本身熒光背景非常低，這對H₂S的高靈敏檢測至關重要。這些探針的羥基基團被酯化，因此呈現出弱熒光和弱的量子產量（Φf < 0.1，見下表1）。

2）靈敏度：探針能與H₂S快速結合熒光信號顯著加強，僅幾分鐘熒光信號急劇增加且達到穩態（見表2）。在梯度濃度的H₂S體系中，最大發射波長下的熒光信號與濃度呈現良好的線性關系。

3）選擇性：探針表現出良好的H₂S特性行結合，與包括Cys和GSH在內的反應性硫類物質相比（見Fig 1）。

Fig 1. Fluorescence intensity of the probes (10 μM) in the presence of various reactive sulfur species: 1) control; 2) 50 μM NaHS; 3) 200 μM Cys; 4) 200 μM GSH; 5) 200 μM Hcy; 6) 200 μM Na₂SO₃; 7) 200 μM Na2S2O3; 8) 50 μM NaHS + 200μM Cys; 9) 50 μM NaHS + 200μM GSH. WSP1 (a), WSP2 (b), WSP3 (c), WSP4 (d), and WSP5 (e).

4）穩定性：在細胞內酯酶（esterase E-0887，from rabbit liver）存在的情況下探針表現

出良好的穩定性。適合活細胞熒光成像研究（見Fig 2）。

Fig 2. Fluorescence intensity of the probe (10 μM). 1) control, without the esterase; 2) incubate with esterase (0.06 U/mL) at room temperature for 30 min; 3) incubate with 50 μM NaHS for 5 min after 2). WSP1 (a), WSP4 (b), WSP5 (c).

5）適用性：適用于細胞內H₂S檢測（Fig 3）。

Fig 3. Fluorescence images of H₂S in HeLa cells usingWSP4andWSP5. (a-f) Cells on 24-well plate were incubated withWSP4(30 μM) for 30 min, then washed and subjected to different treatments. (a and b) control (no NaHS was added); (c and d) treated with 30 μM NaHS; (e and f) treated with 60 μM NaHS. (g-l) Cells on 24-well plate were incubated withWSP5(50 μM) for 30 min, then washed and subjected to different treatments. (g and h) control (no NaHS was added); (i and j) treated with 50 μM NaHS; (k and l) treated with 100 μM NaHS. (Scale bar: 100 nm)

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見我公司（上海諾寧生物）網站查看具體探針的化學特征和使用方法。

系列專題二、硫化氫（H2S）熒光探針（AzMC、C-7Az）

產品特點

我公司（上海諾寧生物）提供一種基于香豆素的硫化氫（H₂S）熒光探針—7-Azido-4-methylcoumarin (AzMC、C-7Az)，這款探針由XJ Tang團隊開發并經多方驗證非常適合生物樣本的H2S檢測。此探針特點如下：

 1）  與硫化氫反應的工作原理

Fig 4. C-7Az（AzMC）與H₂S反應的工作原理

2）  低背景和高靈敏度

C-7Az在脫氣的PBS緩沖液（10mM，pH 7.4）中無熒光，一旦加入NaHS（H₂S供體），C-7Az即可開啟熒光反應，最大吸收峰呈現~15nm的紅光遷移，在340nm下激發發生顯著的熒光增強。如Fig 5所示，加入30μM NaHS（H₂S供體）10min后，熒光增加高達36倍；加入30μM NaHS（H₂S供體）60min后熒光增強108倍。

Fig 5. Fluorescence response of 100 mM C-7Az to 30μM NaHS. Data were acquired at 25℃ in 10 mM degassed PBS buffer (pH 7.4) with excitation at 340 nm. Emission was collected from 400 to 550 nm at 0, 2, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50, and 60 min after the addition of 30μM NaHS. The image shows C-7Az solutions before and after the addition of NaHS within 1 h upon the excitation from the bottom.

3）  高選擇性

與其它陰離子和生物線管的反應硫化物（RSS）、反應氧物質（ROS）和反應氮物質（RNS）相比，C-7Az高選擇性結合硫化氫。如Fig 6所示，加入100μM C-7Az，含100μM NaHS的體系內445nm處的相對熒光強度，比其它1mM相關的RSS、ROS、RNS和陰離子體系高31-60倍。

Fig 6. Fluorescence responses of 100 μM C-7Az to biologically relevant RSS, RNS, ROS and other anions. Bars represent the mean fluorescence responses at 0, 1, 4, 7, 10, 20, 30, 40 and 50 min after the addition of 100 mM H2S or 1 mM of all other species. All measurements were done in black 96-well plates. Data were acquired in 10 mM degassed PBS (pH ? 7.4) at 37℃ after subtraction of the background of PBS buffer, λEx/Em=340/445 nm (filter: 420 nm, PMT: medium) through top-reading using a Molecular Devices FlexStation III microplate reader.

4）  良好的線性關系

C-7Az在脫氣的PBS緩沖液和各種濃度的胎牛血清（0.25-100μM）中與H2S反應，呈現出良好的線性關系（如Fig 7）。

Fig 7. Hydrogen sulfide concentration-dependent fluorescence intensitydetermined using black 96-well plates through top-reading: C-7Az: 100 μM, NaHS: 0.25, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μM in degassed PBS (■) and commercial fetal bovine serum ( ) (37℃, λEx/Em=340/445 nm, filter 420 nm, PMT: medium).

5） 適用于細胞內H2S檢測（Fig 8）。

Fig 8. Visualization of exogenous H₂S with C-7Az probe in HeLa cells using two-photon laser scanning confocal microscopy images. (a) HeLa cells incubated with 50 mM C-7Az for 30 min at 37℃ followed by PBS washing and 30 min incubation in phenol red free media; (b) the bright-field image of (a); (c) the overlaid image of (a) and (b); (d) HeLa cells incubated with 50 μM C-7Az for 30 min, followed by PBS washing and 30 min incubation of 100 μM NaHS in phenol red free media at 37℃; (e) the bright-field image of (d); (f) the overlaid image of (d) and (e). Images were taken with a Nikon CLSM. All images conditions are identical. Scale bars represent 100μm.

6） 適用于原位觀察心肌組織H2S（Fig 9）。

Fig 9. In situ visualization of cardiac tissues with H2S chemoselective probe C-7Az. (a) Tissue image of control rats with PBS working fluid. (b) Tissue image of control rats with C-7Az working fluid. (c) Tissue image of AS rats with C-7Az working fluid. (d) Tissue image of AS rats with exogenous injection of NaHS and C-7Az working fluid. All imaging conditions are identical. Scale bar represents 70 μm.

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注意事項：

1.      所有產品僅供科研用途，絕不可用作臨床或診治用途。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。