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<NBS2004> X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽(X-beta-D- glucuronide CHA salt)

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<NBS2004> X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽(X-beta-D- glucuronide CHA salt)

X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽
NBS2004-100MG
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品牌:NoninBio
價格: 330.00~7000.00
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X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽(X-beta-D- glucuronide CHA salt)

——轉基因植物最常用報告基因GUS顯色底物,GUS染色定性研究

X-Gluc 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸環己胺鹽

NBS2004-100MG

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品牌:NoninBio

作用機制:

X-Gluc,也稱為5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸),是β-葡萄糖苷酶(β-glucuronidase,GUS)的顯色底物,由一種廣泛使用的報告基因gusA(uidA)所編碼。GUS水解X-Gluc,生成一種無色的葡萄糖醛酸和一種肉眼可見的氯-溴靛藍(chloro-bromoindigo)深藍色沉淀。利用這一特性,X-Gluc常用來檢測植物細胞和組織中的GUS表達;另外,X-Gluc還能用來檢測大腸桿菌引起的感染狀況;或檢測食物或水源是否受細菌污染。


主要應用:轉基因植物報告基因GUS活性檢測,X-gluc用作顯色底物。

普遍應用優勢在于:絕大多數植物細胞內不存在內源性的GUS活性,而且GUS基因表達產物具有檢測方法簡單、靈敏度高,易于定量及定性分析,能夠與其他蛋白質基因融合等優勢,因此,GUS基因為植物工程研究中應用最廣泛的報告基因(報道基因)之一。

 

1. GUS活性檢測(組織化學定位法,定性研究)

GUS催化底物X-gluc在酶活性位點生成深藍色沉淀,為研究外源基因在植物中表達具體部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和顯色產物非常穩定,植物中可以積累。

1.1 GUS染色液制備【作為參考,可按照具體實驗條件來調整】

試劑名稱

配制方法

用量

備注說明

X-Gluc儲存液(10mg/ml)

溶解1mg X-gluc于0.1ml甲醇,低速漩渦充分溶解;

100μL

最早實驗使用DMF作為X-gluc溶劑,但是有研究發現DMF會抑制GUS活性,使用甲醇作為溶劑可將GUS活性提高25%。

2x buffer

磷酸鹽緩沖液pH 7.0 (0.1 M NaH2PO4/0.1 M Na2HPO4);

檸檬酸-鹽酸溶液pH 7.0 (0.1 M sodium citrate/ 0.2 N HCl);

1ml

體外X-gluc活性(熒光定量染色)顯示,使用檸檬酸鹽酸溶液可將GUS活性提高20%。


0.1 M potassium ferrocyanide

將4.2239g亞鐵氰化鉀溶于水,定容至100ml。

20 μL

亞鐵-/鐵-氰化鉀的最佳工作濃度需要摸索,建議最好起始工作濃度為1 mM。

0.1 M potassium ferricyanide

將3.2924g鐵氰化鉀溶于水,定容至100ml。

20 μL

10% Triton X-100


10 μL


H2O


850μL


 

1.2 GUS定性染色步驟

a)于預冷固定液(4%多聚甲醛溶液,新鮮制備)固定樣本30min,偶爾搖晃或置于低速搖床上固定;

b)使用預冷的1×磷酸鹽或檸檬酸鹽酸溶液清洗固定樣本30-60min,中間更換幾次清洗液;

c) 真空滲透法將X-Gluc染色液加入待染色樣本【對于組織培養的擬南芥不需用真空滲透;】黑暗條件室溫或者37°C孵育幾小時或過夜,或者明顯的藍色沉淀出現(不超過24h);

d)去離子清洗染色樣本;

e) 對于綠色樣本,使用70%乙醇脫色直到葉綠體完全去除,然后轉移到去離子水內清洗;對于種子或其他樣本,參考文獻An Improved Clearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法;

f) 肉眼或顯微鏡下觀察,白色背景上的藍色小點即為GUS表達位點。


2.  GUS活性檢測(熒光分析法,定量研究)

GUS催化熒光底物MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸,將其水解為4-MU(4-甲基傘型酮)和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在365nm的光激發下產生455nm的熒光。此時用熒光分光光度計測定得到的是相對值,因此同時需要用標準物4-MU進行校準。

熒光定量分析GUS活性有兩種基本方法:

1)在一個時間點測定GUS酶作用產物的總熒光量,需要設定空白對照,以消除內源熒光強度;

2)測定一段時間內GUS的動力學過程。在酶反應初始階段,酶作用產物與時間呈線性關系,而內源性熒光物質的熒光量與時間無線性關系。由此可計算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白質。有時也可以用樣本的鮮重來表示。


2.1  檢測步驟【僅作參考,根據具體實驗條件做適當調整

a)取約100mg愈傷組織或一片新鮮葉盤于1.5ml離心管內,加入100μl萃取緩沖液(extraction buffer)內勻漿。可加入少量沙子或玻璃珠提高研磨效率。

萃取緩沖液(extraction buffer)配方:50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),10mM DTT,1mM Na2EDTA,0.1%十二烷基肌氨酸,0.1% Triton X-100

b)4°C,15,000rpm離心5min。收集上清轉移到另一干凈的1.5ml離心管,冰上放置待用。

c) 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C預熱的反應緩沖液(Assay buffer);用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應緩沖液(Assay Buffer):稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液,此時即為1mM MUG反應液。4°C保存,2周穩定。

d)在某一時間段內(高GUS活性樣本30min;或低GUS活性1h-過夜;)吸取100μl溶液到含900μl終止液(Stop Buffer)的1.5ml離心管內,做好標記。有可能采集3-4個時間點和過夜孵育的時間點熒光量。【用熒光分光光度計在激發波長365nm、發射波長455nm下,狹縫10nm時測定不同時間點的熒光強度值。】

e)以熒光強度值對反應時間作曲線,求出單位時間的熒光強度變化。用單位時間的熒光強度變化除以參加反應的蛋白量,求出單位質量的蛋白單位時間的熒光強度變化。


基本特性:

1)CAS NO:114162-64-0

2)英文同義名:5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, cyclohexylammonium salt;X-beta-D- glucuronide CHA salt;X-Gluc CHA Salt; X-glu CHA Salt; X-glcA CHA Salt; BCIG CHA Salt;

3)分子式:C14H13BrClNO7 ? C6H13N

4)分子量:521.79g/mol

5)純度:>99%(HPLC)

6)外觀:白色至類白色結晶性粉末

7)溶解性:DMF、甲醇

8)化學結構式:


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