iFluor^TM 680 Phalloidin iFluor 680標記鬼筆環(huán)肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環(huán)肽及偶聯(lián)物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產(chǎn)品專題。

產(chǎn)品簡介：

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結(jié)合肌動蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動蛋白），不會結(jié)合單體肌動蛋白（G-actin）。不像肌動蛋白抗體，同時識別單體和聚合形式的肌動蛋白。鬼筆環(huán)肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環(huán)肽分子的化學(xué)計量比結(jié)合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動蛋白親和力會發(fā)生明顯變化。鬼筆環(huán)肽的非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色和未染色區(qū)域的差異極其明顯。鬼筆環(huán)肽使得肌動蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強劑。另外，產(chǎn)生的復(fù)合物高度穩(wěn)定（解離常數(shù)約3×10–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環(huán)肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實用和方便的探針，對組織切片、細胞培養(yǎng)物或無細胞體系內(nèi)的F-actin進行定性和定量研究。另外，鬼筆環(huán)肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經(jīng)標記后的F-actin仍維持許多標記前的功能。比如，標記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標記的肌動蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質(zhì)中移動。

本品為iFluor 680熒光標記的鬼筆環(huán)肽（iFluor 680-Phalloidin），以凍干粉形式提供。按照100μl/孔（96孔板），總共可做300次。

產(chǎn)品特點:

1.  選擇性染色F-actin，優(yōu)于抗體染色法，具更高的特異性和更低的非特異背景。

2.  優(yōu)秀的熒光亮度和穩(wěn)定性，類同于Alexa Fluor680-Phalloidin，Ex/Em=681/698nm。

3.  優(yōu)化用于固定和透化處理樣本。

4.  適用于多重標記應(yīng)用，與其他熒光染料包括熒光蛋白、Qdot熒光納米晶和其他包括二抗在內(nèi)的熒光偶聯(lián)物完全兼容。

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養(yǎng)物內(nèi)的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關(guān)重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優(yōu)秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實驗材料準備

1.1 iFluor 680 Phalloidin（Cat# NBS5840）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細胞培養(yǎng)級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8  黑框/透明底的96孔細胞培養(yǎng)板

二、染色工作液準備

2.1 于實驗前將低溫保存的iFluor 680Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。

2.2 往瓶內(nèi)加入30μl高質(zhì)量無水DMSO，充分溶解，用槍吹勻，即得到1000×儲存液。按照單次用量進行分裝，置于-20℃避光保存，至少6個月穩(wěn)定。

2.3 開始實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1μl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來計算，準備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進行染色，但需調(diào)整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時間取決于特定的應(yīng)用。根據(jù)特定的細胞類型和/或細胞/組織對探針的通透性來調(diào)整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環(huán)肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進行細胞培養(yǎng)，使其貼壁生長達到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現(xiàn)配的iFluor 680Phalloidin染色工作液到每個孔內(nèi)，室溫避光孵30-90min。

【注意】：若有需要，此時可加入即用型DAPI染色液或其他不同于iFluor 680熒光光譜的細胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）到孔內(nèi)保護熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，選擇iFluor 680激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=681/698nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時請注意防護。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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