iFluor^TM 680 Phalloidin iFluor 680標記鬼筆環肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環肽及偶聯物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產品專題。

產品簡介：

鬼筆環肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結合肌動蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動蛋白），不會結合單體肌動蛋白（G-actin）。不像肌動蛋白抗體，同時識別單體和聚合形式的肌動蛋白。鬼筆環肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環肽分子的化學計量比結合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動蛋白親和力會發生明顯變化。鬼筆環肽的非特異性結合幾乎可忽略，染色和未染色區域的差異極其明顯。鬼筆環肽使得肌動蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強劑。另外，產生的復合物高度穩定（解離常數約3×10–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實用和方便的探針，對組織切片、細胞培養物或無細胞體系內的F-actin進行定性和定量研究。另外，鬼筆環肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經標記后的F-actin仍維持許多標記前的功能。比如，標記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標記的肌動蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質中移動。

本品為iFluor 680熒光標記的鬼筆環肽（iFluor 680-Phalloidin），以凍干粉形式提供。按照100μl/孔（96孔板），總共可做300次。

產品特點:

1.  選擇性染色F-actin，優于抗體染色法，具更高的特異性和更低的非特異背景。

2.  優秀的熒光亮度和穩定性，類同于Alexa Fluor680-Phalloidin，Ex/Em=681/698nm。

3.  優化用于固定和透化處理樣本。

4.  適用于多重標記應用，與其他熒光染料包括熒光蛋白、Qdot熒光納米晶和其他包括二抗在內的熒光偶聯物完全兼容。

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，1年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養物內的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實驗材料準備

1.1 iFluor 680 Phalloidin（Cat# NBS5840）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細胞培養級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8  黑框/透明底的96孔細胞培養板

二、染色工作液準備

2.1 于實驗前將低溫保存的iFluor 680Phalloidin置于室溫回溫至少20min，低速離心后才開瓶。

2.2 往瓶內加入30μl高質量無水DMSO，充分溶解，用槍吹勻，即得到1000×儲存液。按照單次用量進行分裝，置于-20℃避光保存，至少6個月穩定。

2.3 開始實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）將其稀釋到1×染色工作液（比如1μl儲存液加入1ml PBS Buffer），用槍吹勻即可。

【注①】：以96孔板為檢測體系，按照100μl/孔來計算，準備足量的染色工作液；也可對細胞爬片進行染色，但需調整染色工作液的用量，以能覆蓋住細胞為準。

【注②】：最佳的工作濃度和孵育時間取決于特定的應用。根據特定的細胞類型和/或細胞/組織對探針的通透性來調整合適的染色條件。

【注③】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環肽粘附到管壁的可能性。

【注④】：染色工作液現配現用，室溫避光保存。

三、染色流程（以96孔板為例）

3.1 用黑框/透明底的96孔板進行細胞培養，使其貼壁生長達到70-80%的匯合度。

3.2 吸掉培養液，用37℃預熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

3.3 用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10-30min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取100μl現配的iFluor 680Phalloidin染色工作液到每個孔內，室溫避光孵30-90min。

【注意】：若有需要，此時可加入即用型DAPI染色液或其他不同于iFluor 680熒光光譜的細胞核染色液。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 加抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）到孔內保護熒光。

3.10 熒光顯微鏡下觀察染色結果，選擇iFluor 680激發/發射濾片（Ex/Em=681/698nm）。若做細胞核染色，選擇合適濾片，比如DAPI激發/發射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時請注意防護。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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