TRITC Phalloidin TRITC標記鬼筆環肽

【溫馨提示】：見我司整理的鬼筆環肽及偶聯物（Phalloidin and Phalloidin Conjugates）產品專題。

產品簡介：

鬼筆環肽（Phalloidin），又稱鬼筆鵝膏素，最初是從毒蘑菇鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）中分離到的一種七肽毒素，以極高的親和力和特異性結合肌動蛋白絲F-actin（聚合形式的肌動蛋白），不會結合單體肌動蛋白（G-actin）。不像肌動蛋白抗體，同時識別單體和聚合形式的肌動蛋白。鬼筆環肽對大小纖維的親和力相近，在許多不同的動植物物種的肌肉和非肌肉細胞中，基本都按照一個肌動蛋白亞基與一個鬼筆環肽分子的化學計量比結合。不像肌動蛋白抗體，對不同物種或來源的肌動蛋白親和力會發生明顯變化。鬼筆環肽的非特異性結合幾乎可忽略，染色和未染色區域的差異極其明顯。鬼筆環肽使得肌動蛋白聚合/解離的臨界濃度降至1μg/ml，可用作一種聚合增強劑。另外，產生的復合物高度穩定（解離常數約3×10–8M），能夠抑制細胞松弛素、碘化鉀和溫度上升引起的去聚合和去組裝活性。

鬼筆環肽及其衍生物在納摩爾濃度即可對F-actin染色，且水溶性良好，是非常實用和方便的探針，對組織切片、細胞培養物或無細胞體系內的F-actin進行定性和定量研究。另外，鬼筆環肽及其衍生物很小，直徑約12–15 ?，分子量<2000 Da，經標記后的F-actin仍維持許多標記前的功能。比如，標記的甘油抽提肌纖維仍能收縮；標記的肌動蛋白絲仍能在固相肌球蛋白基質中移動。

本品為TRITC熒光標記的鬼筆環肽（TRITC-Phalloidin），以溶于甲醇的20μM儲存液形式提供，具體的工作濃度請參考文獻或自身實驗體系來調整，常用濃度范圍80-200nM。按照100nM的工作濃度來算，可進行300次細胞染色。

產品應用：

1） 對固定的組織切片和組織細胞培養物進行肌動蛋白絲（F-actin）的熒光染色；

2） 體外制備穩定的熒光肌動蛋白絲（F-actin）；

保存條件: 

-20℃避光保存，1年有效。

操作流程（免疫熒光染色）

有幾種方法都能用來染色組織細胞培養物內的肌動蛋白絲（F-actin）染色，其中，固定步驟在獲得可信且具代表性的細胞F-actin分布情況中至關重要。固定步驟基于實驗自身需求來選擇。多聚甲醛或戊二醛都能得到優秀的F-actin染色和良好的板狀偽足維持保存。

一、實驗材料準備

1.1 TRITC Phalloidin（Cat# NBS5832）

1.2 1.2 1 x PBS緩沖液（細胞培養級別）（Cat# NBS3021）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）（Cat# NBS0135）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑（Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032或DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）

1.6 即用型DAPI染液（Cat# NBS1206）

1.7 （可選）牛血清白蛋白 (第五組分)（Bovine Serum Albumin，BSA）（Cat# NBS0218）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

二、染色工作液準備

2.1 剛收到或第一次使用時，將充分融化的本品（20μM儲存液）根據單次使用量進行分裝，置于-20℃避光保存，一年穩定。

2.2 正式實驗前，使用1×PBS Buffer（pH 7.4）稀釋儲存液到需要的工作濃度，常用的工作濃度范圍為80-200nM。可以100nM為起始工作濃度，最佳的工作濃度請參考文獻或根據實驗室現有體系來摸索。

【注①】：可使用含1% BSA的PBS Buffer稀釋儲存液，能夠降低非特異背景染色，也能最小化鬼筆環肽粘附到管壁的可能性。

【注②】：染色工作液現配現用，室溫避光保存。

三、染色流程

3.1 細胞爬片培養，使其密度至少達半匯合。

3.2 吸掉培養液，用37℃預熱的1×PBS Buffer（pH 7.4）清洗細胞2次。

 3.3用溶于PBS的4%多聚甲醛固定細胞，室溫固定10min。【注意】：固定過程中甲醇能破壞肌動蛋白，因此，固定液中最好避免接觸任何甲醇。最好的固定液是無甲醇的甲醛。

3.4 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.5 用破膜緩沖液透化細胞，室溫處理5min。

3.6 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.7 取200μl現配的TRITC-Phallodin染色工作液，完全覆蓋蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30min。【注意】：通常情況4℃-37℃都適合用于染色。為了避免工作液的揮發，孵育過程將蓋玻片置于一密封的容器內。

3.8 用1×PBS Buffer清洗細胞2-3次，室溫下30s/次。

3.9 取200μl DAPI溶液（100nM）或商業化的即用型DAPI染色液對細胞核復染，室溫約30s。

3.10 用1×PBS Buffer清洗細胞1-2次，室溫下30s/次。

3.11 將蓋玻片倒置在滴有一滴抗熒光淬滅劑（如Fluoromount-G抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0032）的載玻片上。用紙巾輕輕吸掉多余淬滅劑，然后用透明指甲油密封蓋玻片四周。將此法處理玻片置于4℃避光存放至少6個月仍能維持F-actin染色。

【可選】：完成步驟3.8后，直接將蓋玻片倒置在含DAPI的抗熒光淬滅劑（如DAPI Fluoromount-G 抗熒光淬滅封片劑，Cat# NBS0033）的載玻片上。然后吸掉多余淬滅劑并用指甲油密封蓋玻片四周。

3.12 熒光顯微鏡下觀察染色結果，選擇TRITC激發/發射濾片（Ex/Em=546/575nm）和DAPI激發/發射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

注意事項：

1.      本品具有一定的毒性，LD50=2mg/kg，操作時請注意防護。

2.      本品（Cat#NBS5832）以溶于甲醇的儲存液（20μM）形式提供，300T包裝，適合用量少的研究者；另提供凍干粉形式（Cat# NBS5833），1mg包裝，相對更經濟，適合用量多的研究者；

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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