RiboGreen RNA檢測試劑

產(chǎn)品簡介：

RiboGreen是一種超靈敏的熒光核酸染料，用于溶液內(nèi)RNA的定量檢測。在大量分子生物學(xué)實驗過程中對微量RNA的檢測和定量特別重要，這些過程包括：體外轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)量的測定，以及在進(jìn)行Northern Blot、S1核酸酶實驗、RNase保護(hù)實驗、cDNA文庫制備、逆轉(zhuǎn)錄PCR和差異顯示PCR前對RNA濃度的測定。

核酸濃度測定最常見的方法是測量260nm波長處的吸光值（A260），然而，基于吸光值檢測法主要的缺點在于蛋白和游離核苷酸對光信號具有較大的干擾；以及檢測靈敏度較低（A260=0.1相當(dāng)于溶液中4μg/mL的RNA）；而應(yīng)用靈敏的熒光核酸染料能避免很多由于這些因素引起的問題。

RiboGreen能定量濃度低至1ng/mL的RNA，通過熒光酶標(biāo)儀、標(biāo)準(zhǔn)的熒光光度計或濾光熒光計來測量。此探針與RNA結(jié)合后的最大激發(fā)波長~500nm，最大發(fā)射波長~525nm。用熒光酶標(biāo)儀讀數(shù)，200μL的反應(yīng)體系可檢測低至200pg RNA，這一靈敏度比基于溴化乙錠的熒光分析法高200倍，比基于紫外吸收峰的分析法高1000倍。使用兩個染料濃度，RiboGreen可測量的RNA濃度線性范圍可達(dá)3個數(shù)量級，從1ng/mL到1μg/mL RNA（見Fig 1）。高寬度實驗（High-range assay）能定量20ng/mL-500ng/mL的RNA，低寬度實驗（Low-range assay）能定量1ng/mL-50ng/mL的RNA，即使體系內(nèi)存在核酸制備物中常見的幾種雜質(zhì)（包括：核苷酸、鹽類、尿素、乙醇、氯仿、表面活性劑、蛋白和瓊脂糖），也能維持這一線性關(guān)系。另外，RiboGreen也會結(jié)合DNA，先用DNase預(yù)處理混合樣品，再用RiboGreen進(jìn)行RNA選擇性的定量分析。

我司可根據(jù)用戶需求提供多種規(guī)格的RiboGreen RNA檢測試劑（RiboGreen RNA Reagent），本品以溶于DMSO的母液形式提供，濃度為200×（High-range assay），濃度為2000×（Low-range assay）。

若按照2ml反應(yīng)體系來計算（比色皿），10×100 μL規(guī)格可做200次反應(yīng)（High-rangeassay），10×100 μL規(guī)格可做2000次反應(yīng)（Low-range assay）。

Fig. 用RiboGreen RNA試劑測量RNA標(biāo)準(zhǔn)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線：High-range assay (A)和Low-range assay(B)。

保存條件: 

2-6℃避光保存，亦可置于-20℃避光保存。至少1年有效。

需自備材料：

1）無核酸酶水

2）20× TE緩沖液（RNase-free）

3）RNA Standard

4）【可選】熒光比色皿以及熒光光度計

5）【可選】全黑96孔板以及熒光酶標(biāo)儀

反應(yīng)緩沖液準(zhǔn)備：

TE buffer（10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5）用來稀釋RiboGreen試劑和RNA樣品，必須保證TE buffer沒有受到核酸及核酸酶的污染。在處理和準(zhǔn)備各種材料及試劑時應(yīng)佩戴一次性手套。所有的溶液應(yīng)該存放在無菌的一次性塑料瓶或無核酸酶污染的玻璃瓶中。應(yīng)使用無核酸酶污染的吸管。

【注意】：用戶可直接購買商業(yè)化或自行配制1×TE buffer, Nuclease-free；或直接購買商業(yè)化或自行配制20×TE buffer, Nuclease-free。如果手頭是20×TE buffer, Nuclease-free，于實驗前，用Nuclease-free water稀釋到1×TE buffer, Nuclease-free。

產(chǎn)品使用：

1.概述

在RiboGreen的RNA定量檢測中，為了獲得完全的線性動力學(xué)范圍，需要使用兩個不同的染料濃度。在準(zhǔn)備RiboGreen的工作液之前（見下試劑準(zhǔn)備），需要先決定是希望測定高寬度實驗（High-range assay）（20ng/mL-500ng/mL RNA），還是低寬度實驗（Low-range assay）（1ng/mL-50ng/mL RNA），或兩個范圍都要檢測。

2.試劑準(zhǔn)備

實驗當(dāng)天，在無菌的一次性聚丙烯塑料管內(nèi)制備RiboGreen的水溶性工作液。避免使用玻璃器皿，因RiboGreen可能粘附到玻璃表面。制備好的RiboGreen工作液需避光保存。最好在工作液配制后數(shù)小時內(nèi)用完，不要長期保存待用。

3.準(zhǔn)備RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

對于標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以使用商業(yè)化的RNA Standard，比如：普遍使用的16S和23S核糖體RNA；或其它純化的RNA制品。有的時候，推薦使用與待測定樣本類似的RNA標(biāo)準(zhǔn)來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來說，絕大多數(shù)單鏈的RNA分子能產(chǎn)生幾乎等同的熒光信號。在核苷、鹽、尿素、乙醇、氯仿、去污劑、蛋白質(zhì)和瓊脂糖這些常見的污染核酸試劑的化合物存在時，RiboGreen的檢測結(jié)果仍可維持良好的線性關(guān)系，即使熒光強(qiáng)度可能會受到影響（見附表1）。為了確保達(dá)到有效的對照，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的RNA溶液應(yīng)該與待測樣本保持一致，這樣能保證含接近相似水平的雜質(zhì)化合物。

3.1在塑料瓶中用1×TE buffer配制濃度為2 μg/mL RNA溶液。用比色杯在1cm長度通路下測量該RNA溶液在260 nm (A260)下的基本吸光值，A260＝0.05相當(dāng)于RNA濃度2 μg/mL。

3.2制作High-range標(biāo)準(zhǔn)曲線時，通過稀釋2 μg/mL RNA溶液配制一系列的2×終濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液至一次性無核酸酶的塑料管中，最后轉(zhuǎn)移到比色皿或培養(yǎng)板中。

3.3制作Low-Range標(biāo)準(zhǔn)曲線時，通過稀釋2 μg/mLRNA溶液配制一系列的2×終濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液至一 次性無核酸酶的塑料管中，最后轉(zhuǎn)移到比色皿或培養(yǎng)板中。

3.4等體積混合RiboGreen試劑工作液 （見 2-試劑準(zhǔn)備）和2×RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。于室溫避光孵育2-5min。務(wù)必確保測量容器內(nèi)加入了足夠體積的測量液，對10×10mm比色皿來說，不能低于2 mL；對96孔板的各孔來說，不要低于200 μL。

3.5選擇使用熒光光度計或熒光酶標(biāo)儀來測定樣本熒光值，選擇標(biāo)準(zhǔn)的熒光素波長（激發(fā)~480nm，發(fā)射~520nm）。

3.6將每個樣的熒光值減掉空白的熒光值。之后使用校正好的熒光值為縱坐標(biāo)，RNA濃度為橫坐標(biāo)，來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.樣本分析

4.1用1×TE buffer稀釋樣品到合適體積（比如：1.0 mL到10×10 mm比色杯或100 μL到96孔微孔板）。最好每個待測樣本做不只一個稀釋倍數(shù)。

待測樣本稀釋倍數(shù)越高，越有助于降低特定污染物的干擾作用。然而,也要避免特別小的樣本體積，因為難以準(zhǔn)確測量。另外，同一個實驗中，雜質(zhì)水平盡量保持一致，要降低雜質(zhì)引起的樣品之間信號差異。 例如，如果一系列RNA樣品含鹽濃度相差很大，那么它們就無法用一個簡單的標(biāo)準(zhǔn)曲線來進(jìn)行比較。為了避免這樣的問題，如果可能，調(diào)整所有樣品中雜質(zhì)濃度到相同水平。（見5-樣本中的DNA清除）

4.2每個樣品中加入等體積的RiboGreen測量試劑（見2-試劑準(zhǔn)備），于室溫避光孵育2-5min。

4.3選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線測定時相同的儀器參數(shù)來測定樣本熒光值。為了降低光漂白效應(yīng)，所有樣本的熒光測定時間保持不變。

4.4將每個樣的熒光值減掉空白的熒光值。根據(jù)已經(jīng)產(chǎn)生的RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣本的RNA濃度。

4.5可能的話，通過做不同的樣本稀釋再重復(fù)測定，來驗證定量結(jié)果。

5.樣本中的DNA清除

RiboGreen也可以結(jié)合DNA。可以先用無RNA酶的DNA酶來去除樣本中的DNA，從而避免由于DNA和RiboGreen結(jié)合產(chǎn)生的熒光干擾，確保樣品中的熒光全部來自RiboGreen和RNA的結(jié)合。

5.1準(zhǔn)備10× DNase digestion buffer：無核酸酶的200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM MgCl₂ , 20 mM CaCl₂。

5.2向每個含DNA樣品中加0.11倍體積的10×DNase digestion buffer。（例如，如果樣品為9 mL，就加入1mL的10× buffer）。

5.3按照1 μg DNA添加~ 5 unit的無RNase的DNase I。

5.5 37°C孵育90min。

5.5用1×TE buffer至少10倍稀釋樣品以降低消化液中殘留鹽離子對RiboGreen測量產(chǎn)生干擾。

5.6按照上述步驟進(jìn)行RiboGreen測定實驗。

附表1 RNA制備產(chǎn)物中常見污染化合物對RiboGreen定量的影響

注意事項：

1.      操作過程中，需注意防止RNase污染RiboGreen RNA Reagent。使用潔凈的一次性手套來處理所有材料。

2.      目前尚無關(guān)于RiboGreen對人體的致突變性或毒性的數(shù)據(jù)。由于該染料與核酸結(jié)合，應(yīng)當(dāng)被看作潛在誘變劑，使用時要小心謹(jǐn)慎。在處理DMSO儲存液時應(yīng)特別小心，因DMSO能促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。染料的廢棄處理應(yīng)當(dāng)符合當(dāng)?shù)氐囊?guī)定。

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。