Sulfo-Cyanine3 NHS Ester 磺化Cy3 NHS酯（水溶性）

產品簡介：

花菁類染料（Cyanine Dyes）是一種在兩個氮原子間含聚亞甲基橋鍵且攜帶一非定域電荷的分子。歸其結構特征，花菁素具有極其高的消光系數通常高于100,000 L?mol^-1?cm^-1。不同的替代基允許控制發光團的性能比如吸光波長，光穩定性和熒光強度。例如，通過選擇不同長度的聚亞甲基橋鍵能夠控制吸光和熒光波長：花菁素越長，吸光和發射波長更高，高達至近紅外區。

在生命科學領域廣受歡迎的花菁類染料由美國卡耐基梅隆大學（CMU）的Alan Waggoner教授和同事于二十世紀90年代早期研發應用。這些染料呈現出低的生物分子非特異性結合，并由其巨大的消光系數和良好的量子產量產生明亮的熒光。目前商業化可提供各種反應性衍生物，比如點擊化學用的N-羥基琥珀酰亞胺酯，馬來酰亞胺，疊氮化物和其他衍生物。

目前花菁染料常以兩種異構體的形式供應：一種非磺化的花菁類染料和磺化的花菁類染料，對于許多應用，兩種是可以互相替換的，因其光譜屬性基本相同。兩種染料都可用于DNA和蛋白質等生物分子的標記。兩者的區別在于溶解度：磺化染料具水溶性，可以在水環境中標記，無需有機共溶劑，且在水中不易聚集。

Sulfo-Cyanine3 NHS Ester (Sulfo-Cyanine3 SE)是Cyanine3的水溶性、胺反應活化酯，能夠在純水溶性環境或無任何有機溶劑反應體內進行蛋白和多肽的有效標記。非常適合具極低水溶性和易變性蛋白的標記。

產品特性：

1） 同義名：Sulfo-Cyanine3 NHS ester; Sulfo-Cy3 NHS ester; Sulfo-Cyanine3 SE; Sulfo-Cy3琥珀酰亞胺酯；Sulfo-Cy3 NHS酯；

2） 分子式：C₃₅H₄₀N₃KO₁₀S₂

3） 分子量：765.95 g/mol

4） 外觀：紅色至深紅色結晶粉末或固體

5） 溶解性：溶于水，DMF，DMSO 

6） Ex/Em：~548/562 nm

7） 摩爾吸光系數：150, 000 L?mol^-1?cm^-1

8） A₂₈₀/A_max：8%

9） 光譜相似染料：Alexa Fluor^? 555, DyLight^? 555

保存條件: 

-20°C避光干燥保存，2年有效。

產品使用：

【注意】：Cy染料和生物分子的比例（F/P）=4~12之間熒光強度最高。F/P過高，熒光探針會自我淬滅并且影響生物分子的活性。CyDye NHS在pH 8.5~9.4內標記抗體10min，F/P可達5~6。但在pH 7.0內幾乎無反應。我司內部使用Cy3NHS標記Anti-GST抗體發現按1:1，1:5，1:10，和1:20標記得到的F/P分別為0.28:1，1.16:1，2.3:1和4.6:1。

一、 水溶性Cy3NHS標記Anti-GST抗體【其它CyDye NHS參考此方法進行并做適當摸索】

商業化購買的抗體如果含有其他蛋白（如血清白蛋白，明膠等），或溶于帶氨基的緩沖液，會影響標記。需在標記前對抗體進行純化。

1. 于1L 0.15M NaCl溶液中透析Anti-GST（0.5ml，3mg/ml），室溫或4℃透析4h。

2. 換用1L新鮮的0.15M NaCl溶液，4℃透析過夜。

3. 第二天再換用1L 0.1M NaHCO₃（pH 8.3），4℃透析4h。

4. 【可選】用0.22μm低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

5. 用0.1M NaHCO₃（pH 8.3）稀釋少量的抗體，于280nm測其紫外吸收值并計算標記抗體的總量（IgG抗體摩爾吸光系數為170,000 at 280nm）。

6. 用DMSO配制Cy3 NHS（MW:765.95），濃度為10mg/ml。根據CyDye NHS和抗體的使用比值（比如1:20）來計算所需要染料的體積。然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時于暗處低速攪拌，室溫45min。

7. 用1L 0.15M NaCl溶液，常溫或4℃避光透析4h，以除去未標記上的Cy3 NHS。

8. 換用新鮮的1L 0.15M NaCl溶液，4℃避光透析過夜。

9. 換用1L 0.01M PBS/0.01% NaN3溶液室溫或4℃避光透析4h，然后在4℃避光再次透析過夜。

10. 【可選】用0.22μm低吸附濾膜過濾透析后的抗體溶液。

11. 用0.01M PBS/0.01% NaN3溶液整數倍稀釋標記抗體，測定280nm（蛋白）和552nm（Cy3）處的紫外可見吸光度。

12. 產品冷凍干燥成粉末或置于0.01M PBS/0.01% NaN3溶液中，-20℃避光保存。

【F/P計算】：

Cy3在552nm下的摩爾吸光系數為150,000L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy3本身在280nm處的吸收是552nm處的8%。按照以下公式計算F/P值。

[Cy3] = A552/150000; [Antibody] =[A280-(0.08×A552)]/170000

F/Pfinal =[Cy3]/ [Antibody]= [1.13×A552]/[A280-(0.08×A552)]

二、 水溶性Cy5 NHS標記（D-ser2）- Leu-Enkephalin【其它CyDye NHS參考此方法進行并做適當摸索】

1. 低溫保存的Cy5 NHS置于室溫回溫至少20min。往1mg粉末內加入400μl高品質無水DMSO充分溶解。同樣，低溫保存的玻璃瓶裝的（D-ser2）- Leu-Enkephalin（YSGFLT，0.75mg）室溫回溫后加入400μl高品質無水DMSO充分溶解。將400μl Cy5 NHS加入400μl多肽內。【染料與多肽通常質量比1:1】。

2. 再加入15μl三乙胺，常溫避光攪拌反應混合物，過夜。【若多肽穩定性較弱，則于4℃反應過夜】。

3. 用HPLC純度多肽。使用C18柱子（25cm×10mm），每次上樣注入2×400μl，30min梯度洗脫從0.1% TFA水溶液到MeCN:H2O (0.1% TFA)=70：30，流速4ml/min。（對不同的多肽選擇不同的合適HPLC梯度流動相）

4. 收集適當的色帶峰，標記多肽的保留時間比未標記的多肽長。

5. 產品冷凍干燥成粉末或置于水溶液中，-20℃避光保存。必要時可用質譜表征。

6. CyDye標記的蛋白/多肽穩定性取決于蛋白本身。例如標記的IgG在4℃可避光保存2月，更長保存需加入等體積甘油-20℃避光保存。

【F/P計算】：

Cy5在650nm下的摩爾吸光系數為250,000L?mol-1?cm-1，此蛋白在280nm的摩爾吸光系數為170,000 L?mol-1?cm-1，不同蛋白的摩爾吸光系數不同。Cy5本身在280nm處的吸收是650nm處的5%。按照以下公式計算F/P值。

[Cy5] = A650/250000; [Peptide] =[A280-(0.05×A650)]/170000

F/Pfinal =[Cy5]/ [Peptide]= [0.68×A650]/[A280-(0.05×A650)]

注意事項：

1.      Sulfo-Cyanine3 NHS Ester水溶液的穩定性很弱，建議現配現用。Sulfo-Cyanine3 NHS Ester DMSO溶液的穩定性相對高，建議置于-20℃避光保存，2周穩定。

2.      Sulfo-Cyanine3 NHS Ester具水溶性，除非標記實驗嚴格要求純水溶性環境，建議用DMSO溶解配制成母液后使用。一般情況下，Cy系列染料在含有機溶劑體系內的標記效率相對高些。

3.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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