D-Luciferin Firefly, Free Acid D-螢火蟲熒光素（游離酸）

 溫馨提示：見我司整理的活體成像研究底物之：Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）產品專題。 

產品簡介：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個生物技術領域，特別是體內活體成像技術。作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發光。當熒光素過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞后，導入研究動物如大小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。目前有三種產品形式：D-熒光素（游離酸），D-熒光素鹽（鈉鹽和鉀鹽）。主要差別在于溶解特性：

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內實驗。配成溶液后的三種產品，在絕大多數應用上都沒有實質性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒有差別，主要是使用習慣等因素影響。整體來看，鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。

基本特性：

1） CAS NO：2591-17-5

2）  化學名：(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid; D-Luciferin Firefly, free acid D-螢火蟲熒光素游離酸，D-甲蟲熒光素游離酸；

3） 分子式：C11H8N2O3S2

4） 分子量：280.32 g/mol

5） 純度：＞99% (HPLC)

6） 外觀：類白色至淺黃色粉末

7） 溶解性：溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50mg/ml），溶于弱堿，微溶于水

保存條件: 

-20℃干燥避光儲存，有效期2年。

產品使用：

A．體外生物發光檢測

1. 儲存液制備

【注意】：建議大量實驗前先取少量原料（D-熒光素游離酸）溶于你的緩沖液，以測試其溶解性。

【配置方法】：要溶解螢火蟲熒光素游離酸到生理鹽中，首先用NaOH或KOH調整緩沖液到預測的摩爾堿度，然后加入D-熒光素游離酸（如15mg/ml），邊攪拌邊促進溶解。如果仍有沉淀，調整pH到更高直至完全溶解。最后用酸調整pH到所需值。混勻后立即使用或分裝于-80℃避光凍存，避免反復凍融。

2. 熒光素酶反應緩沖液制備

2.1 配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250μM CoA，150μM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來調整。按照以上配方制備熒光素酶反應緩沖液（2×）。

3. 收集細胞裂解上清（熒光素酶表達）

根據需要檢測的細胞類型，選擇合適的裂解液進行細胞裂解，離心收集上清后續檢測待用。

4. 螢火蟲熒光信號檢測

【注①】：螢火蟲熒光信號的檢測方法大體上取決于冷光測定儀（luminometer）類型（是手動型熒光計、單管注射型或者酶標板讀數型熒光計）。根據特定發光測定儀，來考慮注射用量和程序設置。

【注②】：需設置不含熒光素酶的孔（用作陰性對照），以測定背景熒光。

例：注射式冷光測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200μl終體積）

a）吸取100μl熒光素酶反應緩沖液（2×）到一干凈的冷光測定儀比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98μl裂解上清到皿或孔內；

c）如果有需要，用水來補足使得總體積到198μl；

d）設置程序注射2μl熒光素儲存液（使工作濃度150μg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測定。

B．活體成像分析

1）工作液準備：準備少量的PBS（w/o Mg²⁺）, pH=12以及PBS（w/o Mg²⁺）, pH=2緩沖液。先取10mg D-熒光素游離酸到165ml PBS（w/o Mg²⁺）, pH=12，充分溶解后，再加入165ml PBS（w/o Mg²⁺）, pH=2中和溶液，混勻得到30mg/ml的工作液。0.2μm濾膜過濾除菌。混勻后立即使用或分裝于-80℃避光凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射方式：適用于靜脈注射，腹腔注射，肌肉注射和鼻內注射等，根據具體方式調整注射體積，最常用的注射濃度為150mg/kg體重。

3）檢測方式：注射入體內10-20 min（待光信號達到最強穩定平臺期），再進行成像分析。

【注意】：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。

注意事項：

1.      螢火蟲熒光素（firefly luciferin）和甲蟲熒光素（beetle luciferin）皆相同化合物，即：(S)-2-(6-Hydroxy-2- benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylic acid，僅不同公司在命名上的差異。

2.      螢火蟲熒光素（firefly luciferin）在保存和操作的過程中需要避光。另，水溶性儲存液經過濾除菌后，可置于-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。若條件允許，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩定性和保存時間更長，長達1年。

3.      螢火蟲熒光素（firefly luciferin）的注射方式，以及動物類型、體重等都會影響熒光信號發射，建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定最佳信號平臺期和最佳檢測時間。

4.      紫外線和潮氣會產生脫氫熒光素，是一種熒光素酶的競爭性抑制劑。因此需小心保存和處理D-熒光素。最好-20℃避光干燥保存。

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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