BCFL AM (Superior replacement for BCECF AM) pH熒光探針

【務(wù)必注意】：初次使用離子探針的用戶，強(qiáng)烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細(xì)胞培養(yǎng)級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內(nèi)加載性。 

產(chǎn)品簡介：

BCFL AM是一種細(xì)胞膜滲透性的熒光探針，用來測定相對的胞內(nèi)pH變化。是常用的比率型pH探針-BCECF（2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)- Carboxyfluorescein）的優(yōu)越替代物。與BCECF不同（至少由三種異構(gòu)體構(gòu)成的一種復(fù)合物，不同異構(gòu)體之間的比率因批次而異），BCFL是單一異構(gòu)體，具有更優(yōu)秀的結(jié)果重復(fù)性。BCFL具有與BCECF相同的光譜反應(yīng)（單波長測定λex/λem=490/535nm；或比率測定λex/λem=505/ 535nm和λex/λem=430/535nm）（光譜特征見附錄I）。BCFL AM表現(xiàn)出pH依賴的雙激發(fā)性，pKa~7.0，以及一個激發(fā)交點（454nm）。BCFL AM的比率型成像使得胞內(nèi)pH測定基本不受幾種可變因素的影響，包括染料濃度、光徑、細(xì)胞泄露和光漂白率。

產(chǎn)品特性：

1）  同義名：BCFLAM ester;BCFLAcetoxymethyl Ester;

2）  分子量：~600

3）  溶解性：溶于DMSO

4）  Ex/Em：503/528nm

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少1年有效。

產(chǎn)品使用：

A、試劑準(zhǔn)備

1. 10% Pluronic F-127母液配制【可選】

a）將1g Pluronic F-127（貨號：NBS2009-1g）溶于10ml去離子水，配制成10%（w/v）母液。

b）溶解過程中于40~50℃內(nèi)加熱10% Pluronic F-127母液30min，使其完全溶解。

c）10% Pluronic F-127母液室溫保存，高達(dá)6個月穩(wěn)定，不要凍存。

2. HHBS Buffer或其他生理緩沖液

3. 丙磺舒（貨號：NBS2007-1g）或水溶性丙磺舒（貨號：NBS2008-154mg）【可選】

B、操作步驟

【注意】：以下實驗步驟中用到非離子表面活性劑Pluronic F-127和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運抑制劑丙磺舒（Probenecid），這兩種試劑雖然都是非必需的，但強(qiáng)力推薦使用。

1. 制備BCFLAM母液：于實驗前，將低溫保存的BCFLAM粉末（Mw：~600）置于室溫回溫至少20min。低速離心后加入高質(zhì)量無水DMSO配制成10~20mM母液。比如：1mgBCFLAM粉末加入166μl DMSO充分溶解，混勻后即得到10mM母液。多余的母液根據(jù)單次用量分裝，避光凍存，約3個月穩(wěn)定

2. 用HHBS或其他的生理緩沖液制備2×工作液（含10μMBCFLAM和0.08%Pluronic F-127），比如，在合適的管子內(nèi)混合6.4μlBCFLAM（10mM儲存液）和51.2μl 10%Pluronic F-127。之后，添加HHBS或其他生理緩沖液直到總體積為6.4ml。

【注意】：對于大部分的細(xì)胞系，建議BCFLAM的工作濃度為4~5μM。Pluronic F-127的終濃度建議為0.02~0.04%。

3. 吸取100μl 2×工作液到含100μl細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔內(nèi)，混勻，使得BCFLAM的終濃度為5μM和Pluronic F-127的終濃度為0.04%。

4. 置于37℃孵育30~60min。之后置于室溫孵育30min。

5. 吸走200μl染色液，之后重新加入含1mM丙磺舒的HHBS Buffer或其他生理緩沖液。

6. 添加化合物到檢測孔內(nèi)。之后通過熒光檢測來進(jìn)行pH分析。

【單波長檢測：Ex/Em=490/535nm（cutoff=515nm）；或比率測定

Ex/Em=505/535nm和430/535nm（cutoff=515nm）】

注意事項：

1.      熒光染料都存在淬滅問題，操作或保存過程中盡量避光，減緩熒光淬滅。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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