Cal-590 AM, Cell Permeant 鈣離子熒光探針

【務必注意】：初次使用離子探針的用戶，強烈建議配合：Pluronic F-127, Cell Culture Tested 細胞培養級（NBS2009-1g）一起使用，以提高探針的水溶性和胞內加載性。 

產品簡介：

鈣離子測定在各種生理活動中發揮著重要作用，與鈣離子結合從而表現出光譜反應的熒光探針使得研究人員能夠觀察胞內游離鈣離子水平變化，通過熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光光度計和熒光酶標板來檢測。
新一代鈣離子熒光探針：Cal-520，Cal-590和Cal-630是最強大且均一的細胞內鈣流（Calcium mobilization）測定用熒光探針，與傳統的鈣離子探針（比如：Fluo-3 AM、Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，具有明顯改善的信噪比和細胞內滯留性。
Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM具有細胞膜滲透性，能夠預加載進入細胞。一旦進入細胞候，親脂阻斷基團AM被酯酶裂解，產生帶負電荷的熒光染料，留在細胞內部。一旦與鈣離子結合后，它們的熒光顯著加強。當細胞被激動劑刺激后，受體發出細胞內鈣釋放的信號，從而使得Cal-520，Cal-590和Cal-630的熒光增加。Cal-520 AM，Cal-590 AM和Cal-630 AM的高靈敏度以及>100倍的熒光增強使其成為胞內鈣離子測定的理想探針。高信噪比和更加的胞內滯留性使其成為評估GPCR和鈣離子通道靶標以及篩選對應激動劑和拮抗劑的優秀工具。

Cal-520，Cal-590和Cal-630基本定位在細胞質，不像Rhod-2主要定位在線粒體。Cal-590和Cal-630的長激發/發射波長使其為完美的鈣離子探針，能夠與綠色熒光蛋白（GFP）標記細胞兼容多色檢測。另外，Cal-520，Cal-590和Cal-630也與絕大多數現存的熒光儀器兼容。Cal-520在488nm處被良好激發，用FITC濾片檢測；Cal-590經優化在555nm處被良好激發，用TRITC/Cy3濾片檢測；Cal-630經優化在594nm處被良好激發，用Texas Red濾片檢測；

產品特性：

1）同義名：Cal-590, Acetoxymethyl Ester;

2）分子量：分子量：1266.81

3）解離常數：K_d=561 nM

4）溶解性：DMSO

5）Ex/Em：574/588

保存條件: 

-20℃干燥避光保存，有效期至少1年。

產品使用：

A， 試劑準備

1） 配制Pluronic F-127母液： 稱取100mg  Pluronic F-127粉末（貨號：NBS2009）中加入500μl DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解過程需要在40-50℃加熱20-30min。溶液室溫保存，不用冷藏。如有結晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2） HHBS Buffer (1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer, pH 7.2-7.4) 或者其他生理緩沖液

B，操作步驟

1） 用無水DMSO溶解Cal-590 AM配制成2-5mM的儲存液，或將已配好的Cal-590 AM儲存液取出于室溫回溫。（如：若配制成4mM的母液，需向50μg Cal-590 AM中加入9.8μl 無水DMSO）。

2） 用HHBS或其他生理緩沖液將Cal-590 AM+DMSO儲存液稀釋到含0.04% Pluronic F-127的10-20μM染色工作液。

【注①】：添加一定量的20% Pluronic F-127溶液到Cal-590 AM+DMSO儲存液，使Pluronic F-127的濃度約為0.04%。Pluronic F-127可以防止AM探針在溶液中聚合并促使探針更好進入細胞。但Pluronic F-127可降低AM探針的穩定性，因此只建議在配制工作液時加入，不建議加入儲存液長期保存。

【注②】：Cal-590 AM應用在大部分細胞的推薦加載濃度為4-5μM，具體的使用濃度需根據實驗要求進行優化。為了避免過度加載造成細胞毒性，建議在取得有效結果的基礎上盡量使用最低探針濃度。

【注③】：Cal-590 AM工作液需現配現用，避免反復凍存。

3） 【可選】如果細胞內（比如CHO細胞）含有機陰離子轉運體，丙磺舒（Probenecid，1-2mM）可能需要加入上述染色工作液內（在孔內的最終濃度為0.5-1mM），以降低去酯化探針的泄露水平。

【注①】：我司提供多種丙磺舒：包括水溶性的丙磺舒（NBS2008-154MG），能降低有機溶劑的使用。

4） 加入等體積的染色工作液到細胞培養孔內，37℃孵育60-90min。然后，室溫再孵育30min。

【注①】：某些細胞系探針的加載時間長于2h能提供更好的信號。

5） 吸掉染色工作液，并用HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）清洗細胞1~2次，以去除殘留探針。

6） 之后在HHBS或其他生理緩沖液（如有必要，使用含轉運體抑制劑如1mM 丙磺舒的緩沖液）中，用合適的激發/發射波長來檢測熒光（見產品特性：Cal-590 AM的激發和發射光譜）。

【注①】：對于熒光顯微鏡檢測，建議用TRITC/Cy3濾片來檢測，建議用黑框/透明底的細胞培養板。

【注②】：對于熒光酶標儀檢測，建議用激發波長：540nm，發射波長590nm，cut-off波長570nm來檢測，建議用黑框/透明底的96孔板；

注意事項：

1.      熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.      乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后請在干燥的環境放至室溫后再開封。由于試劑微量，開封前請將其短暫離心，以保證粉末落入管底

3.      Cal-590, AM在4℃、冰浴等較低溫度情況下會凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內，可在20-25℃溫育片刻至全部融解后使用。

4.      Cal-590, AM第一次使用，建議儲存液現配現用，分裝成單次用量，嚴格做到≤-20℃密封干燥凍存，以防止受潮。為了保證良好的實驗效果，盡量在短時間內使用

5.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

附錄I Cal-520，Cal-590或Cal-630鈣離子探針的波長和鈣離子結合特性