外泌體快速純化試劑盒

產品介紹

1 產品描述
本試劑盒通過束縛水分子使溶解度較低的外泌體和其他細胞外囊泡（EVs）等細胞膜囊泡析出，隨后可通過短時間的低速離心來收集這些難 溶組分。另外本試劑盒通過一系列的配方優化，提高了外泌體的回收率，適用于下游的細胞共培養、電鏡分析、Western Blot、熒光定量 （qPCR）和高通量測序等應用。

2 外泌體功能介紹
外泌體和其他細胞外囊泡（EVs）屬于細胞膜囊泡，包含蛋白，mRNA，microRNA，DNA和脂類。外泌體直徑 30-150nm，多種細胞在正常及病 理狀態下均可分泌外泌體，其主要來源于細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外基質中，且外 泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。外泌體具有多種多樣的功能，其功能取決于其所來源的細胞類型，其可參與 到機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、腫瘤侵襲等。

3 外泌體的形成過程
膜雙層通過磷脂的不對稱分布來維持脂質的“多面性”。外膜富含磷脂酰膽堿和鞘磷脂，而內膜主要由磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺形成。微泡由質膜出芽形成，主要原因是由于 Ca2+通過磷脂雙分子層破壞了膜的不對稱性，導致磷脂跨膜雙層的重新分配， 促進膜起泡，最終導致出芽過程的進行，出芽形成芽泡，將泡體中的外泌體釋放到細胞外，這樣就形成了一個完整的外泌體。

4 試劑盒組份
該試劑盒主要包括兩種試劑，具體見下表：

表1：試劑盒組分

5 樣本選擇
外泌體快速純化試劑盒適用于多種樣本的外泌體提取與純化，我們測試過培養基上清、血清、血漿以及尿液樣本，都能夠滿足下游檢測和鑒定需求，但植物外泌體沒有進行測試，客戶如有需求可自行檢測。

使用方法
1 樣品預處理
取待純化的樣品進行差速離心，首先用300g離心10min，繼續收集上清，再用2000g離心10min，最后用10000g再離心10min，將收集的上清用0.22μm的濾膜進行過濾處理（可選）。

2 樣品中外泌體提取
將上一步收集的濾液樣本與 QE-Buffer A按 2:1混合（50ml的樣本加入 25ml的 QE-Buffer A），充分混勻后 4℃過夜孵育，注意混勻后最好是 靜置孵育過夜，不要在混合器上旋轉。

3 外泌體濃縮富集
將孵育后的混合液在 4℃下 12000 rpm離心1h，用一定體積的 QE-Buffer B重懸沉淀（50ml的樣本加1ml QE-Buffer B重懸），也可根據沉淀 的量調整 QE-Buffer B的重懸體積，用移液器輕輕吹打混勻后，在室溫放置 30min可充分溶解。

4 外泌體保存與應用
將收集的外泌體溶液保存于-20℃或-80℃冰箱中，盡量避免反復凍融，可分裝以備下游檢測和應用。如需無菌培養，可使用 0.22 μm無菌過濾 器進行過濾收集。

注意事項
1) 本試劑盒無菌無熱源，請在潔凈環境下使用；
2) 所有試劑在低溫中取用，所有操作盡量在低溫環境下進行，這樣可以更好的保持外泌體的完整性；
3) 外泌體較脆弱，建議盡量在低溫下進行操作，防止外泌體活性受損，影響下游實驗；
4) 提取的外泌體保存在-20℃或-80℃中，可保存半年時間，外泌體分裝使用，盡量避免反復凍融。

參考信息
293細胞外泌體純化：
1) 取 50ml培養基上清，差速離心去除顆粒沉淀，加入25 ml的 QE-Buffer A溶液；
2) 混勻后，靜置于 4℃過夜孵育；
3) 4℃，12000 rpm離心 1 h回收沉淀，并使用 1ml QE-Buffer B溶液重懸沉淀；
4) 對洗脫產物進行標志物蛋白的 WB檢測、納米流式檢測以及電鏡檢測，

常見問題與解答

1 如何快速鑒定純化后的產物是否含有外泌體？
1) 直接裂解洗脫樣本，通過吸光值、BCA或者Bradford檢測下蛋白濃度，通常外泌體的獲取量和蛋白濃度呈現正相關；
2) 外泌體檢測最直接的方式是仍然是 WB檢測，外泌體的幾個特征性標志物 CD9、CD63、CD81、TSG101和 HSP70等，通常 WB選用 2-3個 特異性蛋白進行WB檢測可初步判斷樣品中是否含有外泌體。

2 為何洗脫后的樣本中不含有外泌體或含量低于正常值？
1) 可能是樣本中所產生的外泌體較少，適當擴大預處理的樣本容量，并排除培養過程中因活率過低或其它原因導致的外泌體污染；
2) 雖然看不見但可以結合下游實際需求進一步分析，可組合其它的檢測方法如 WB、納米流式等進行輔助驗證；
3) 在實際提取分離過程中是否嚴格按照說明書要求進行分離純化，排除是否因操作不當造成樣本的流失；
4) 根據所提取樣本的特性而定，提取本試劑盒推薦來源以外的外泌體時，并不能夠保證提取效率與從 293細胞培養基上清中提取效率相當,但仍需盡可能保證 4℃的條件下進行,排除外泌體降解的可能以及樣本來源差異。

3 如何長時間保存外泌體洗脫液？
1) 外泌體會降解不推薦長時間保存，如果不得以需要長期儲存，建議在-20℃或-80℃下保存最長不超過 30天，若在 4℃下儲存最長不超過 7 天；
2) 注意分裝，避免反復凍融。

4 外泌體分離方法哪種方式最好？
1) 沒有最好的方法，主要根據實驗需求而定，本款試劑盒的最大特點就是比傳統的超速離心法更快，且對設備的依賴性更低；
2) 有條件的情況下可以嘗試多種方式組合提取。

保存與運輸
運輸：冰袋運輸，不可凍結。
保存：2-8 ℃冷藏保存，不可凍結。