干貨 | WB 實驗中的關鍵控制點和注意事項
滿懷期待跑 WB，拍照后卻發(fā)愁了，條帶怎么這么弱？這種時候，相信很多小伙伴都百思不得其解，除了發(fā)問“條帶去哪了”，還一度相信 WB 就是門玄學。長此以往，大家面對 WB 實驗似乎都抱有“心誠則靈”的無力態(tài)度，萬一成功了呢？
玩笑歸玩笑，言歸正傳，面對不好拿下的 WB 實驗，“心誠則靈”是有道理的。“心誠”的意思是，面對失敗的實驗我們有必要用心逐一排查問題所在，優(yōu)化實驗體系。總而言之在繁瑣復雜的 WB 面前，沒有任何捷徑。
本期的干貨課堂我們就來重點探討 WB 實驗中的一些關鍵控制點，并提供實用的 Tips 供大家參考。
WB 實驗步驟
WB 實驗中的關鍵控制點和注意事項
Key Points about WB
一
WB 樣本的制備
將樣品置于冰上或者維持在 4℃ 下
選擇合適的抑制劑
抑制劑推薦
蛋白酶抑制劑
在細胞破裂蛋白抽提的過程中，這些蛋白酶也會被一起釋放出來，混入蛋白樣品中，對蛋白樣品造成降解
磷酸酶抑制劑
*（檢測磷酸化條帶時必須要添加）
磷酸酶機理：通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和自由的羥基
二
選擇合適的蛋白定量方法
進行 Bradford 分析、Lowry 分析或二喹啉甲酸 (BCA) 分析
通常使用牛血清蛋白 (BSA) 作為蛋白質(zhì)標準品
三
WB 電泳分離
用還原及變性的緩沖液 (e.g. Laemmli buffer)將蛋白變性，準備上樣
使多肽帶上負電荷
使蛋白變性并將多肽拉直
將二硫鍵打斷
使抗原表位暴露出來
凝膠上樣
20-40 μg 全細胞裂解液或 100 ng 純化蛋白
每條泳道上相同蛋白量
根據(jù)目標蛋白的表達量優(yōu)化上樣量
分離膠選擇 Tips（FuturePAGE蛋白預制膠）
分子量 4-40 kDa，分離膠濃度 20％
分子量 12-45 kDa，分離膠濃度 15％
分子量 10-70 kDa，分離膠濃度 12.5％
分子量 15-100 kDa，分離膠濃度 10％
分子量 25-200 kDa，分離膠濃度 8％
四
WB 的蛋白轉(zhuǎn)膜
電泳結(jié)束后，凝膠(帶有已分離的蛋白)與膜緊貼放置，使用電流把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可用麗春紅進行可逆轉(zhuǎn)色判斷轉(zhuǎn)移效果。
膜的類型
硝酸纖維素膜（NC 膜），韌性差，低背景
Polyvinylidene Difluoride (PVDF 膜轉(zhuǎn)印包)，甲醇激活，蛋白結(jié)合力強
轉(zhuǎn)膜 Tips
對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入 SDS 至終濃度為 0.1％；對于分子量較大的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中使用 10％ 或者更低濃度的甲醇；對于分子量較小的靶蛋白，推薦在轉(zhuǎn)膜緩沖液中使用 20％ 甲醇
對于分子量較大的靶標蛋白，建議使用 0.45 μm 的 PVDF 膜；對于分子量較小的靶標蛋白，建議使用 0.22 μm 的 PVDF 膜
五
WB 的封閉處理
膜封閉處理可降低一抗/二抗的非特異性結(jié)合。
常用的封閉劑
5% 脫脂奶粉 in TBST
5% BSA in TBST
六
抗體孵育
一抗特異性地檢測目標蛋白
一抗室溫孵育 1-2 h 或 4 ℃ 過夜孵育
選用適合的一抗工作濃度或稀釋度
一抗可以用封閉液來稀釋
WB 信
二抗辨認一抗的恒定區(qū)
（具有物種特異性）
二抗室溫孵育 1-2 h
選用適合的二抗工作濃度或稀釋度，一般工作濃度要低于一抗
二抗可以用封閉液來稀釋
二抗帶有標簽
七
WB 的信號檢測
檢測方法分為化學發(fā)光檢測和熒光檢測。
號檢
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