干貨 | DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率受哪些因素影響？
跑電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)基本技術(shù)。而瓊脂糖凝膠電泳作為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的技術(shù)之一，其主要特點(diǎn)有哪些？DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率又受什么因素影響呢？
瓊脂糖作為凝膠電泳常用支持物，其純度會(huì)直接影響DNA的分辨能力及電泳結(jié)果的清晰度。
MonTrack? Agarose瓊脂糖是標(biāo)準(zhǔn)熔點(diǎn)瓊脂糖，專為常規(guī)分離分析而設(shè)計(jì)，可分離50~15,000 bp范圍內(nèi)的DNA和RNA 片段。
MonTrack? High Gel Strength Agarose與高純度瓊脂糖相比，分離范圍相同，硬度提高33%，制膠厚度低至3~4mm時(shí)仍能夠保持凝膠的完整性。
高純度瓊脂糖(ME00101) /高硬度瓊脂糖(ME00201)
我們知道，瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定 DNA、RNA 的方法，這種
DNA 在瓊脂糖凝膠中的遷移速率：
影響因素有哪些？
通過凝膠的電流
根據(jù)歐姆定律 V = IR 式中, V 是電壓; I 是電流（單位安培）; R 是電阻（單位歐姆）。因?yàn)橛糜陔娪镜木彌_液通常是微堿性的（pH 7.8~8.0），通過凝膠的 DNA 分子攜帶負(fù)電荷，并以所施加的電流形成的速率向陽(yáng)極遷移。
DNA 分子的大小
雙鏈 DNA 分子在凝膠基質(zhì)遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)( log10 )成反比（Helling et al. 1974）。大分子 DNA 摩擦阻力大，通過凝膠孔徑的效率低于小分子 DNA ，因此遷移速率慢。
瓊脂糖濃度
瓊脂糖凝膠是由氫鍵和疏水作用聚合在一起的多孔膠體。在電流的作用下，DNA 線性分子通過一系列孔徑泳動(dòng)，這些孔徑的有效直徑取決于凝膠中瓊脂糖的濃度（如下圖所示）。
式中, μ0 是 DNA 自由電泳遷移率， Kr 是阻滯系數(shù)，是一個(gè)與凝膠性質(zhì)、遷移分子大小和形狀相關(guān)的常數(shù)。
DNA 的構(gòu)象
超螺旋環(huán)狀（Ⅰ型）、切口環(huán)狀（Ⅱ 型）和線性（Ⅲ 型） DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率不同（Thorne 1996，1967）。
凝膠和電泳緩沖液中的染料
染料插入雙鏈 DNA 造成其負(fù)電荷減少，而剛性和長(zhǎng)度增加。因此,線狀 DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%（ Sharp et al.1975）。
施加電壓
低電壓時(shí)，線狀 DNA 片段遷移率與所用的電壓成正比。但是，電場(chǎng)強(qiáng)度升高時(shí)，高分子質(zhì)量 DNA 片段的遷移率不成比例增加。所以，當(dāng)電壓增大時(shí)，瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，則所用電壓不應(yīng)高于5~8 V/cm。
瓊脂糖種類
常見的瓊脂糖主要有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖（ Kirkpatrick 1990），正在研制的第三種是熔點(diǎn)和凝點(diǎn)介于上述二者之間的瓊脂糖，它兼有兩者的特性。
電泳緩沖液
DNA 的泳動(dòng)受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子（如用水替代電冰槽及凝膠中的緩沖液）則電導(dǎo)率降至很低。DNA 遷移極慢，或者完全不動(dòng)。高離子強(qiáng)度時(shí)，如錯(cuò)用了10×電泳緩沖液，電導(dǎo)率升高,即使應(yīng)用適中的電壓也會(huì)產(chǎn)生大量的熱量。最嚴(yán)重時(shí)凝膠會(huì)熔化，DNA 會(huì)變性。
有幾種緩沖液適用于天然雙鏈 DNA 的電泳,它們包括 Tris -乙酸鹽和 EDTA 緩沖液（pH 8.0， TAE ,也稱為 E 緩沖液）、Tris -硼酸鹽和 EDTA 電泳緩沖液（ TBE ）或 Tris -磷酸鹽和 EDTA 電泳緩沖液（TPE ），工作濃度約50mmol/ L ，pH 7.5~7.8。各種電泳緩沖液通常配制成濃溶液于溫室存放（見每種實(shí)驗(yàn)方案后的配方）。這些緩沖液都非常有效，選擇哪一種使用主要看個(gè)人工作習(xí)慣。
三者之中 TAE 的緩沖容量最低，如長(zhǎng)時(shí)間電泳會(huì)被消耗。此時(shí)凝膠的陽(yáng)極一側(cè)將發(fā)生酸性化，凝膠中向陽(yáng)極遷移的溴酚藍(lán)的顏色呈現(xiàn)從藍(lán)紫色到黃色的變化。該顏色變化從pH 4.6開始，到pH 3.0終止。定期更換緩沖液或調(diào)換兩個(gè)電極池的緩沖液可以防止 TAE 的消耗。TBE 和 TPE 比 TAE 花費(fèi)稍貴些，但是它們有高得多的緩沖容量。
雙鏈線狀 DNA 片段在 TAE 中比在 TBE 或 TPE 中遷移速率快10%左右。對(duì)于高分子質(zhì)量 DNA ，TAE 的分辨率高于 TBE 或 TPE ；對(duì)于低分子質(zhì)量 DNA ，TAE 要差些。此差別也許解釋下述現(xiàn)象：高度復(fù)雜混合物中的 DNA 片段，如哺乳類動(dòng)物 DNA ,用 TAE 電泳可有較高分辨率。因此，用于分析復(fù)雜基因組的 Southern 印跡( Southern blot )均用 TAE 作為電泳緩沖液制備凝膠和電泳。超螺旋 DNA 在 TAE 中的電泳分辨率要好于 TBE 。
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