Western Blot蛋白免疫印跡(WB)快速實(shí)驗(yàn)攻略

WB即Western Blot，蛋白質(zhì)免疫印跡。是一種基于抗原抗體的特異性結(jié)合，半定量檢測樣品中某種蛋白的技術(shù)。作為分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，WB雖看似??簡單，卻常因各種因素做不出好看的結(jié)果圖，甚至拿不到結(jié)果。今天帶領(lǐng)大家從頭開始，一整個(gè)過一遍超詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程，保管你一學(xué)就會(huì)，結(jié)果圖好看的讓人敬佩！

完整的WB流程，如下圖所示，包含樣本制備、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合、蛋白檢測5個(gè)大步驟。

樣品制備

01蛋白提取（以RIPA裂解液為例）

1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF（Cat# NBS0101），使PMSF的最終濃度為1 mM。

2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS（Cat# NBS3021）、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。細(xì)胞充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。

• 懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必須分裝成0.5-1×106個(gè)細(xì)胞/管，然后再裂解。

• 組織樣本：按照每20mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。??

3）充分裂解后，10000-14000 g離心3-5 min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#NBS5216）打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時(shí)，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

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02蛋白定量

1）配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進(jìn)行稀釋，配置成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。或者您可以選購BCA蛋白濃度測定試劑盒（Cat# BK0001）直接使用。

 2）取25 μL標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品加入到微孔板中。

3）每孔加入200 μL BCA工作液，振蕩30 s充分混勻。蓋上微孔板，37℃孵育30 min。

4）冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的540-595 nm波長范圍處檢測吸光度，其中562 nm波長為最佳。

5）根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度ug/mL；Y-最終的OD562 nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

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SDS-PAGE電泳

電泳凝膠可選擇SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、預(yù)制膠（Bis-Tris體系）三種。

以預(yù)制膠操作為例：

1）剪開包裝取出預(yù)制膠，撕去膠板底端深綠色膠帶，緩慢地拔出梳子，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿電泳緩沖液，外槽液體加入量要高于電泳槽高度1/3。可用移液槍或其他工具吸取電泳緩沖液輕輕吹打加樣孔，去除加樣孔內(nèi)殘留的儲(chǔ)存緩沖液和雜質(zhì)。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液（Cat# NBS1047）。水浴溶解后立即室溫存放。

3）按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱 3-5 min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）在每個(gè)樣品孔中上樣10-30 μg蛋白，并在1個(gè)孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，推薦150 V，跑50-70 min，通常電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳結(jié)束，取出凝膠，使用起膠器或其他合適的工具插入到膠板兩側(cè)之間的空隙中，慢慢的上下撬動(dòng)上、中、下三個(gè)不同的位置，然后在另一側(cè)重復(fù)操作，直至膠板兩側(cè)完全打開。

7）膠板打開后，凝膠可能粘在膠板的任意一側(cè)，將有凝膠一側(cè)的膠板傾斜至水中，輕輕撥動(dòng)凝膠，使凝膠自由掉落到裝有水的器皿中，晃動(dòng)清洗凝膠，然后取出進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。

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轉(zhuǎn)膜與封閉

1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5 min。（如果檢測小分子蛋白質(zhì)，可省略該步驟，因小分子蛋白容易擴(kuò)散）。

2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10 min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2 min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。（膜的選擇：0.45 μm孔徑，用于一般蛋白；0.22 μm孔徑，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用滾輪或試管趕盡氣泡。

4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入Fast Transfer Buffer(20X) 快速轉(zhuǎn)印緩沖液（20X）（Cat# BR0003-01）中350 mA， 40 min完成轉(zhuǎn)膜。

5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5 mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10 min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。注：如果沒有出現(xiàn)染色條帶，則表示轉(zhuǎn)膜失敗，可能需要重新轉(zhuǎn)膜或重新上樣電泳。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清??晰后???拍照，大概沖洗2~3次，每次5 min。???

8）脫色：將膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。

9）清洗：再用TBST（Cat# NBS7510）清洗膜2~3次，每次5 min。

10）將膜置于10~20 mL快速無蛋白封閉液（Cat# BR0051-01）中，在室溫振蕩孵育30 min完成封閉。 

11）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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抗體孵育

1）將膜和一抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10 mL一抗稀釋緩沖液中在4oC下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

2）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min以去除殘留的一抗。

3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10 mL封閉緩沖液中孵育1-2小時(shí)并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。

4）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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蛋白檢測

1）最后一次洗膜的同時(shí)，按照ECL試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。

2）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發(fā)光工作液（125 μL發(fā)光工作液/cm²膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3 min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。

3）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。

4）在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。

5）暗房內(nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時(shí)間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。（從剛開始的10 s曝光時(shí)間中可以看出適當(dāng)?shù)钠毓鈺r(shí)間。由于檢測反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征，在孵育后信號立即變得最強(qiáng)，但在隨后的2小時(shí)內(nèi)會(huì)減弱）

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