外泌體介紹及提取方法

背景介紹：

剛發現外泌體時，這種比多泡體還要小的細胞外囊泡被視為細胞外排出的代謝垃圾，但隨著對這種細胞外囊泡不斷地深入研究，發現這種細胞外囊泡在細胞之間的通訊交流中發揮著極其重要的作用。

外泌體是什么？

外泌體是機體所有活細胞分泌的一種直徑約為30-150nm的細胞外囊泡，廣泛存在于各種生物體液（血液、尿液、母乳、唾液、胸水、腹水、腦脊液等）中。它們由蛋白質、脂質、核酸的特定成分組成，可以將信號傳遞給受體細胞，從而介導細胞間的通訊。外泌體在多種生物學功能中發揮著重要作用，包括參與RNA、蛋白質、酶和脂質等生物分子的轉移，以及各種生理和病理過程的調節。

外泌體屬于細胞外囊泡的一種，根據直徑大小以及釋放機制的不同可將細胞外囊泡主要分為外泌體、微囊泡、凋亡小體，它們都參與細胞間信息傳遞，但目前對于外泌體的研究最多。

表 外泌體與其他細胞外囊泡的區別

圖 外泌體與其他細胞外囊泡

外泌體的結構組成：

外泌體具有脂質雙分子層結構，由膽固醇、鞘磷脂和磷酸甘油酯等成分共同組成，在其脂質雙分子層的表面附著有粘附分子、主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）、大量的特定蛋白質，包括四跨膜蛋白、熱休克蛋白等等和各種特定的配體（CD9、CD63、CD81等）。在外泌體的內腔中還攜帶各種生物活性物質，包括核酸、某些酶類、蛋白分子、細胞代謝物等，核酸例如信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）、脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）和長鏈非編碼核糖核酸（Longnon-coding ribonucleic acid，LncRNA）等。

圖 外泌體的結構組成

外泌體的功能：

外泌體的功能起決于其所來源的細胞類型。外泌體能夠將核酸、蛋白質和脂質在內的多種生物活性分子從供體細胞轉移到受體細胞，介導細胞間通訊和分子轉運；并且外泌體可以由所有類型的活細胞分泌，在體液中廣泛分布。它可參與機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化、細胞遷移、腫瘤侵襲等方面，因此外泌體在生理病理標志物和藥物遞送方面有巨大的應用潛力。

外泌體提取：

進行外泌體研究，首先要將其從樣本中提取出來。目前已有許多基于外泌體物理及生化特性的分離方法，傳統方法包括超速離心、密度梯度離心、超濾、尺寸排阻色譜（size-exclusionchromatography，SEC）、聚合物沉淀法、免疫親和層析，還有一些新的微流體技術、商業試劑盒。

圖 外泌體分離純化方法合集

超速離心：

超速離心法是最常用也是分離外泌體的“金標準”方法。其原理是利用溶液顆粒大小和密度導致沉降速率不同，來分離不同組分。該方法包含以下步驟：低速離心去除細胞和凋亡碎片；其次以更高離心力消除更大囊泡；最后高速離心沉淀外泌體。該方法操作簡便，可以擴展為大規模外泌體制備。在過去30年中，超速離心法被廣泛應用于從細胞培養基、血清、體液中分離外泌體。但是該方法特異性不強、可混有分子量相近的蛋白質，同時高速離心力可能破壞外泌體膜泡影響下游分析。

圖 超速離心法分離外泌體

密度梯度離心：

密度梯度離心利用顆粒大小與密度差異對外泌體進行分離。密度梯度離心會預先使用蔗糖或碘克沙醇制作密度梯度。樣品從頂部加入離心管，在離心過程中逐漸自上而下沉降，在一定密度區間聚集。外泌體通常密度范圍為1.1～1.2g/mL。該方法的局限性是分離樣本容量受到密度區帶寬度的限制，因此密度梯度離心不便于處理大樣本。

圖 密度梯度離心分離外泌體

超濾：

超濾是基于外泌體尺寸進行分離的方法。根據膜孔的尺寸和截留分子量，將小顆粒通過膜孔進入濾液，大顆粒截留在膜表面。超濾的主要缺點為液體流動方向平行膜孔方向，造成大顆粒堵塞膜孔，同時產生的剪切力也會使外泌體變形或裂解。

圖 超濾法純化外泌體

尺寸排阻色譜（SEC）：

SEC原理為根據顆粒尺寸進行分離。在色譜柱中填充多孔固定相，小顆粒可以穿過固定相中的空隙，因此沉降路徑變長，較大顆粒更晚沉降，因此可以分離尺寸差別較大的顆粒。通常SEC會先進行超速離心預處理以此減少雜質、提高純度。SEC最大的優勢是可以很好的保留外泌體活性。

圖 尺寸排阻色譜（SEC）純化外泌體

聚合物沉淀法：

聚合物沉淀原理是利用超親水聚合物，如PEG結合溶液中水分子使溶質溶解度降低進而沉淀析出，最后通過低速離心獲得外泌體。可以廣泛用于各種樣品類型，如血液、培養基、尿液、腦脊液等。其優點是可處理大樣本，產量較高。缺點是分離的外泌體會受到其他蛋白質污染。

圖 聚合物沉淀法純化外泌體

免疫親和層析：

免疫親和層析基本原理通過配體與抗體特異結合進而分離純化。一般用外泌體表面生物標記物作為配體，如四跨膜蛋白超家族、囊泡轉運分類內涵體復合物、復合物相關蛋白。抗體吸附在磁珠、多孔二氧化硅單片板、膜親和過濾器上，溶液通過時可特異結合外泌體表面蛋白進行分離純化。常見方法有基于微孔板的酶聯免疫吸附測定與磁珠免疫捕獲。此類方法具有高特異性，并可以保證外泌體生物活性。

圖 磁珠法免疫捕獲外泌體

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