TRIzol Reagent 總RNA提取試劑

TRIzol Reagent 總RNA提取試劑

產(chǎn)品描述

TRIzol Reagent是一種即用型且操作迅捷的總RNA抽提試劑，適用樣本廣泛，包括人、動物、植物、酵母或細(xì)菌來源的細(xì)胞和組織樣本。TRIzol Reagent是一種含酚、異硫氰酸胍和其他專利成分的單相溶液，有利于抽提分子量大小不一的各種RNA類型。TRIzol Reagent能夠良好的維持RNA完整性，因能高效抑制樣本勻漿過程中細(xì)胞破損和細(xì)胞組分溶解時釋放的RNase活性。TRIzol Reagent能夠同時處理大量樣本，且以優(yōu)化的方式一步法提取RNA，整個過程可在一小時內(nèi)完成。

TRIzol Reagent分離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，適用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、poly(A)+篩選、體外翻譯、RNase保護(hù)分析和分子克隆等下游實驗。

保存與運輸方法

保存：2-8℃保存，至少一年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   所有離心管、槍頭以及相關(guān)溶液都必須無RNase污染。對于塑料制品、玻璃和金屬器皿、實驗儀器等可使用固相RNase清除劑去除RNase，或者用含0.01% DEPC的去離子水浸泡過夜，之后高壓滅菌、烘干。對于實驗溶液可使用液相RNase清除劑來處理或用DEPC處理水來配制。

2）   對新鮮組織或細(xì)胞樣本的抽提效果通常優(yōu)于凍存的組織或細(xì)胞，由于組織或細(xì)胞凍融過程中可能存在一些RNase釋放出來并酶切樣品。若是不能及時提取RNA，推薦先加入適量TRIzol Reagent，之后裂解樣品后再凍存。

3）   TRIzol Reagent含有毒物質(zhì)，請在操作過程中注意好防護(hù)工作，戴好手套和護(hù)眼罩，避免皮膚接觸。在通風(fēng)櫥內(nèi)完成操作，避免呼吸道吸入。

4）  為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.  需要自行準(zhǔn)備的材料

水浴鍋或微量恒溫儀（Heat block）

異丙醇

75%乙醇

含0.5% SDS的RNase-free水或RNase-free水或DEPC處理水

【可選】RNase-free的糖原（核酸助沉劑）

2.  樣本要求

【重要】：樣本收集后立即進(jìn)行RNA分離，或樣本收集后立即凍存樣本并保存在-80℃或液氮中直至RNA提取。

3. 樣本準(zhǔn)備與分相

3.1 根據(jù)起始材料用TRIzol Reagent裂解和勻漿樣本。

◇組織樣本

按比例每50~100mg 組織加1ml TRIzol Reagent，之后用合適的方法進(jìn)行勻漿。通常用50~100mg組織即可獲得足量的RNA，滿足絕大多數(shù)下游實驗。加入過量組織或過少TRIzol都容易導(dǎo)致RNA提取失敗。

a）對于研缽研磨：將液氮凍存組織，放到研缽中研磨成粉末，之后加入1ml TRIzol，繼續(xù)研磨至組織完全裂解【研磨要迅速，最好不要超過1min】。

b）對于玻璃勻漿器勻漿：加入1ml TRIzol上下手動勻漿組織10~15次。

c）對于機(jī)械勻漿器：將組織放入塑料管內(nèi)，將塑料管置于冰浴燒杯內(nèi)，加入1ml TRIzol，將分散器頭垂直插入管內(nèi)與組織直接接觸，設(shè)置轉(zhuǎn)速12,000~20,000 rpm，上下移動試管10~20次，直至組織完全打散，無明顯可見大塊即可。

◇單層生長的細(xì)胞

吸盡培養(yǎng)基，之后往35mm培養(yǎng)皿（10cm²）內(nèi)加入1ml TRIzol Reagent，晃動3~5次，再用移液槍上下吹打3~5次，使其充分裂解。【按照10cm²培養(yǎng)面積加入1ml TRIzol加量。比如：六孔板每孔加入1ml TRIzol，12孔板每孔加0.5ml TRIzol】

◇  懸浮生長的細(xì)胞

離心收集細(xì)胞，吸盡上清，每5-10×10⁶個細(xì)胞（動植物或酵母來源）或1×10⁷個細(xì)胞（細(xì)菌來源）加入1ml TRIzol Reagent【加入TRIzol前不要清洗細(xì)胞，否則會增加mRNA降解的可能性】。用槍吹打幾次或適當(dāng)渦旋，使其充分裂解。某些酵母和細(xì)菌如裂解不充分，可用勻漿器勻漿，使其完全裂解。

【注意】：樣本體積不要超過加入TRIzol體積的10%。 

3.2 特殊樣本處理【可選】：對于某些富含蛋白，多糖或脂肪的樣本，經(jīng)TRIzol Reagent裂解后可能會有不溶物或油脂狀漂浮物出現(xiàn)。此時需12,000g 4℃離心10min，之后吸取澄清的上清液至一新的離心管中。

3.3 室溫孵育5min，使得核蛋白體完全分解。

3.4 按照每1ml TRIzol Reagent加入0.2ml 氯仿，蓋緊蓋子。渦旋混勻或用手劇烈晃動15s，室溫孵育2~3min。

3.5 于12,000g 4℃離心15min。離心后混合物分為三層：下層酚-氯仿層，中間層，和上層無色的水相層。RNA無一例外的停留在水相層中。水相層的容量約為所加TRIzol Reagent體積的60%。用槍吸取上層無色水相到一新的離心管中，避免吸到任何中間層或下層成分。

【注意】：如果希望分離DNA和蛋白，請保留中間層和有機(jī)層。

4.      RNA分離

4.1    RNA的沉淀：

a）【可選】如果起始樣本量比較少（＜10⁶個細(xì)胞或＜10mg組織），加入5-10μg RNase-free的糖原作為核酸助沉劑到水相中。

b）按每ml起初TRIzol Reagent加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次混勻，室溫沉淀10min。如果希望提取microRNA等小RNA，推薦-70℃沉淀過夜。c）于12,000g 4℃離心10min，在管底可見RNA沉淀，棄上清。

4.2    RNA的清洗：

a）按每ml起初TRIzol Reagent加入1ml 75%乙醇重懸沉淀。【注：RNA在75%乙醇中-20℃至少保存1年，4℃至少1周】；

b）低速漩渦或顛倒混勻，于7,500g 4℃離心5min，棄上清。再用離心機(jī)甩一下（>5,000rpm, 離心1秒），小心吸盡液體。

c）操作的最后，簡單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5~10min）。不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥，否則會極大的降低其可溶性。部分溶解的RNA樣本的A260/A280比值＜1.6。

4.3    RNA的溶解：用20~50μl 無RNases水或含0.5% SDS的無RNases水溶解RNA，用槍上下吹打2~3次，使其充分溶解，置于-70℃保存或直接用于后續(xù)實驗，如果后續(xù)要做酶切反應(yīng)請勿用SDS。

【注意】：對于肝臟、胰腺、腎臟等RNase含量較高的組織，沉淀可用100%去離子甲酰胺溶解。

5.      RNA產(chǎn)量的測定

5.1    用無RNase水稀釋RNA，之后測定在260nm和280nm的吸收值。

5.2    使用公式A260×稀釋倍數(shù)×40= μg RNA/ml。

5.3    計算A260/A280比值，比值在1.8~2.0之間視為純度較高，濃度＞4 μg/ml的樣品適用于分光光度計測定。

5.4    進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。