SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a

產品簡介

SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實時定量PCR預混液，使用時只需加入模板和引物即可進行反應。采用創新的熱啟動機制可以減少引物二聚體和其他次級產物對反應的干擾，可以顯著提高定量PCR的特異性、擴增效率，得到更廣的可定量擴增區域。采用了新的增強劑，對各種目的片段 PCR 效率的波動可控制在最小范圍內，反復凍融對擴增性能影響極小。本品配有進口參比染料ROX，適用于需要ROX校正的定量PCR機型，如ABI等。

產品組成

a 包含SYBR? Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反應緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應體系的2%，請根據需要調整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長期保存。

質量控制

純度檢測：經質量檢測，產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測：經不同來源的模板和引物檢測，產品具有優秀的特異性、靈敏性及可重復性等。

應用舉例

1. 配制反應體系

[1] DNA模板建議用量（10-20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.2-0.6 μM。特異性差時可降低濃度，效率低時可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現雜峰，可以減少Mix用量至8 μl（20 μl體系）；如果對痕量模板的檢出率較低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl體系）。

[4] 對于某些固定型號的儀器，需要添加ROX才能精確測定Ct值。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX的雜峰背景干擾，在應用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項，然后再進行數據的收集與分析。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。

[5] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

2. 設定反應程序進行qPCR反應

注：本品含有熱啟動酶，在60℃時會抑制酶活性，因此不建議使用兩步法，推薦使用經典三步法或極速三步法。

經典三步法程序示例如下：

本品可用極速三步法快速完成反應，程序示例如下：

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。

[2] 150 bp以內的擴增子可設置為5 sec；150-300 bp的擴增子可設置為10 sec；300 bp以上的擴增子可適當延長時間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同，一般按儀器默認熔解曲線采集程序即可。可在延伸（三步法）或退火延伸（兩步法）階段采集信號，也可在反應結束后72 hrs之內采集（避光低溫保存）。

3. 分析結果

觀察擴增曲線；調整基線，計算Ct值；觀察熔解曲線檢測特異性；進行相對或絕對定量。

注意事項

? 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將（n+x）份反應液混勻后再分注到n個單管中，可降低加樣誤差。（n為重復次數，x為損耗量，一般為n的1/10）

? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應液，避免產生氣泡，氣泡會干擾熒光檢測。可瞬時離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實驗結果的重要因素。務必設計特異性好的引物，隨實驗結果適當調整引物用量（0.05-0.9 μM）——特異性較差時減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴增效率較低時增加引物用量。

? DNA模板的量應小于500 ng/反應，過高的模板量會引起非特異性擴增。應根據模板類型與基因表達量適當調整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的，初次使用的引物建議進行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產物的特異性。產物特異性不好的原因有：引物特異性低；退火溫度設置偏低；引物/模板濃度偏高；等。同時，建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的特異性。