SYBR? Green qPCR Mix (with ROX)

Cat. #：P2091a，P2092a，P2093a

產(chǎn)品簡介

SYBR? Green qPCR Mix是2X濃縮的實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混液，使用時(shí)只需加入模板和引物即可進(jìn)行反應(yīng)。采用創(chuàng)新的熱啟動(dòng)機(jī)制可以減少引物二聚體和其他次級(jí)產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)的干擾，可以顯著提高定量PCR的特異性、擴(kuò)增效率，得到更廣的可定量擴(kuò)增區(qū)域。采用了新的增強(qiáng)劑，對(duì)各種目的片段 PCR 效率的波動(dòng)可控制在最小范圍內(nèi)，反復(fù)凍融對(duì)擴(kuò)增性能影響極小。本品配有進(jìn)口參比染料ROX，適用于需要ROX校正的定量PCR機(jī)型，如ABI等。

產(chǎn)品組成

a 包含SYBR? Green I，Hotstart Taq DNA聚合酶，Aptamer，dNTP及反應(yīng)緩沖液等。

* 所配ROX含量為最終反應(yīng)體系的2%，請(qǐng)根據(jù)需要調(diào)整用量。

保存條件

SYBR? Green qPCR Mix -20℃避光保存2年，4℃避光可短期保存。ROX Reference Dye -20℃避光可長期保存。

質(zhì)量控制

純度檢測(cè)：經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，產(chǎn)品不含脫氧核糖核酸內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測(cè)：經(jīng)不同來源的模板和引物檢測(cè)，產(chǎn)品具有優(yōu)秀的特異性、靈敏性及可重復(fù)性等。

應(yīng)用舉例

1. 配制反應(yīng)體系

[1] DNA模板建議用量（10-20 μl體系）：1-10 ng cDNA，或10-100 ng gDNA。加樣體積不宜過小，以免造成較大的誤差，但是cDNA的量不宜超過總體積的1/10。因此模板建議濃度（加樣前）：cDNA 1-10 ng/μl，gDNA 10-100 ng/μl。

[2] 引物終濃度建議范圍：0.2-0.6 μM。特異性差時(shí)可降低濃度，效率低時(shí)可提高濃度。

[3] 如果熔解曲線出現(xiàn)雜峰，可以減少M(fèi)ix用量至8 μl（20 μl體系）；如果對(duì)痕量模板的檢出率較低，可以增加Mix用量至12 μl（20 μl體系）。

[4] 對(duì)于某些固定型號(hào)的儀器，需要添加ROX才能精確測(cè)定Ct值。ROX會(huì)給熔解曲線分析造成一定的背景干擾。因此，為了避免ROX的雜峰背景干擾，在應(yīng)用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測(cè)ROX熒光值選項(xiàng)，然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集與分析。由于ROX的使用體積較小，建議將ROX提前與qPCR Mix混勻使用。ROX用量參照具體儀器說明，下表僅供參考。

[5] 建議總體積不小于10 μl，以免造成較大的加樣誤差。具體體積范圍參考儀器說明。

2. 設(shè)定反應(yīng)程序進(jìn)行qPCR反應(yīng)

注：本品含有熱啟動(dòng)酶，在60℃時(shí)會(huì)抑制酶活性，因此不建議使用兩步法，推薦使用經(jīng)典三步法或極速三步法。

經(jīng)典三步法程序示例如下：

本品可用極速三步法快速完成反應(yīng)，程序示例如下：

[1] 最適退火溫度需要摸索。退火溫度一般設(shè)定為所用引物的Tm-5℃，若低于55℃，則以Tm值為退火溫度，一般不低于55℃。

[2] 150 bp以內(nèi)的擴(kuò)增子可設(shè)置為5 sec；150-300 bp的擴(kuò)增子可設(shè)置為10 sec；300 bp以上的擴(kuò)增子可適當(dāng)延長時(shí)間。

[3] 不同儀器熔解曲線采集程序不同，一般按儀器默認(rèn)熔解曲線采集程序即可。可在延伸（三步法）或退火延伸（兩步法）階段采集信號(hào)，也可在反應(yīng)結(jié)束后72 hrs之內(nèi)采集（避光低溫保存）。

3. 分析結(jié)果

觀察擴(kuò)增曲線；調(diào)整基線，計(jì)算Ct值；觀察熔解曲線檢測(cè)特異性；進(jìn)行相對(duì)或絕對(duì)定量。

注意事項(xiàng)

? 使用前Mix需要完全解凍，充分混勻。盡量避免多次反復(fù)凍融。短期使用可避光保存于4℃。

? 將（n+x）份反應(yīng)液混勻后再分注到n個(gè)單管中，可降低加樣誤差。（n為重復(fù)次數(shù)，x為損耗量，一般為n的1/10）

? ABI的定量儀器大部分需要ROX校正管間差異，Bio-Rad的定量儀器不需要ROX校正。具體儀器請(qǐng)參照其使用說明。

? 輕輕混勻反應(yīng)液，避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)干擾熒光檢測(cè)。可瞬時(shí)離心去除氣泡。

? 引物的特異性、用量以及退火溫度是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。務(wù)必設(shè)計(jì)特異性好的引物，隨實(shí)驗(yàn)結(jié)果適當(dāng)調(diào)整引物用量（0.05-0.9 μM）——特異性較差時(shí)減少引物用量，或以3℃為增量提高退火溫度，擴(kuò)增效率較低時(shí)增加引物用量。

? DNA模板的量應(yīng)小于500 ng/反應(yīng)，過高的模板量會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。應(yīng)根據(jù)模板類型與基因表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整用量。

? 熔解曲線的采集不是必須的，初次使用的引物建議進(jìn)行熔解曲線采集。熔解曲線可以看出產(chǎn)物的特異性。產(chǎn)物特異性不好的原因有：引物特異性低；退火溫度設(shè)置偏低；引物/模板濃度偏高；等。同時(shí)，建議通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。