大型真菌囊泡提取純化試劑盒

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產(chǎn)品簡介：

大型真菌囊泡在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤及神經(jīng)修復(fù)等治療中具有重要作用，但其提取面臨子實(shí)體組織成分復(fù)雜（如多糖、萜類等干擾物）和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密的技術(shù)瓶頸，導(dǎo)致囊泡提取得率低、純度不足。

本試劑盒專為大型真菌設(shè)計，可高效釋放真菌子實(shí)體組織中的囊泡，并去除子實(shí)體組織中的非囊泡成分，獲得的大型真菌囊泡可用于電鏡分析、NTA粒徑分析、核酸分析、蛋白分析、細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)等。

保存條件: 

Solution A -80℃保存，有效期1年，使用前4℃化凍，分裝使用避免反復(fù)凍融；

其他組分常溫運(yùn)輸保存，有效期1年。

產(chǎn)品組成：

* Nuclease-free, Sterile

自備材料：

一、實(shí)驗(yàn)材料/耗材

1、削皮刀、水果刀、玻璃砧板等（可以把待提取大型真菌處理成方便榨汁的小塊的用具）；

2、400 mL燒杯1~2個；

3、50 mL離心管、1.5mL EP管若干；

4、pH試紙，1~10（廣泛），5.5~8.5（精密）。

二、實(shí)驗(yàn)設(shè)備

電子秤；碾磨榨汁機(jī)（推薦使用，可搜索原汁機(jī)購買）；4℃高速離心機(jī)；水浴鍋；渦旋振蕩器。

三、實(shí)驗(yàn)試劑

1×PBS溶液（無菌）

產(chǎn)品使用：

一、榨汁前準(zhǔn)備

1、榨汁機(jī)消毒：將榨汁機(jī)各部件拆分開，噴灑75%酒精仔細(xì)擦拭后，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min；

2、樣品準(zhǔn)備：按照試劑盒處理量準(zhǔn)備待提取樣品；

注：試劑盒處理量

3、樣品處理：將新鮮的待提取大型真菌洗凈外表皮后，用無塵布擦干，放入生物安全柜紫外消毒至少20 min后，將真菌子實(shí)體切成方便榨汁的薄片；

注：一般藥用大型真菌含水量很少，榨汁階段無法出汁，所以盡量將真菌子實(shí)體組織處理成盡可能小的薄片。

二、榨汁取渣

1、榨汁機(jī)準(zhǔn)備：在生物安全柜下，將完成消毒的榨汁機(jī) 部件按照榨汁機(jī)說明書組裝；

2、榨汁取渣：將處理好的真菌子實(shí)體小片投入榨汁機(jī)榨汁，注意少量多次，收集出渣口碾磨粉碎后的真菌渣；

注：a. 如需控制內(nèi)毒素，榨汁取渣過程請?jiān)谏锇踩駜?nèi)進(jìn)行；b. 如果收集到的真菌渣中仍有未粉碎完全的子實(shí)體組織，建議將收集到的真菌渣重新榨汁粉碎。

3、真菌渣分散：向收集好的真菌渣中加PBS，邊加邊攪拌混勻，直至真菌碎渣完全分散在PBS中，且混勻后的液體有良好的流動性；

注：a. 如需控制內(nèi)毒素，榨汁取渣、真菌渣分散過程請?jiān)谏锇踩駜?nèi)進(jìn)行； b. 分散所加的PBS體積需要根據(jù)真菌渣釋放出內(nèi)容物的粘稠程度而定，可以少量多次加，及時攪拌觀察 液體狀態(tài)。

三、提取囊泡

1、汁液預(yù)處理：在分散好的真菌渣液體中加入混勻的Solution A 試劑，添加劑量如下（其他劑量可按添加比例換算）：

注：Solution A 試劑使用前需混勻。

2、混合孵育：加入Solution A試劑后蓋好管蓋，顛倒混勻8~10次，將混合液37℃水浴16 h左右（過夜）；

3、調(diào)pH：將孵育好的混合液取出，在生物安全柜下用試劑盒自帶的1M NaOH和1%檸檬酸將混合液pH調(diào)至7.0；

4、低速離心去雜：將調(diào)pH后的液體于4℃，5,000 ×g，10 min 離心，收集上清；

5、高速離心去雜：將低速去雜后的上清4℃，10,000 × g，20 min離心后再次收集上清；

6、過濾：將上步收集得到的上清依次經(jīng)1 μm濾膜和0.45 μm濾膜過濾；

注：如需獲得30-1000 nm大型真菌囊泡，可只進(jìn)行 1 μm濾膜過濾，不進(jìn)行0.45 μm濾膜過濾。

7、加提取試劑：取上步離心上清液加入Solution B試劑， 添加劑量如下（其他劑量請等比例換算）：

8、二次混合孵育：加入Solution B后擰緊管蓋，通過渦旋振蕩器混勻1 min，將混合液4℃靜置4 h左右；

9、沉淀大型真菌囊泡：取孵育好的混合液于4℃，10,000 ×g，60 min 離心，棄上清，將含有沉淀的離心管再次于4℃，10,000 g，2 min離心后，吸盡上清；

注：沉淀中富含大型真菌囊泡，需盡可能吸盡上清液。

10、大型真菌囊泡重懸：取合適量的 1×PBS 均勻吹打離心沉淀，待其溶解后，將重懸液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP 管中（建議每20 mL汁液用400 μL左右1×PBS重懸）；

11、大型真菌囊泡收獲：將含有重懸液的1.5 mL EP管于 4℃，12,000 ×g 離心 2 min，保留上清液，其中富含大型真菌囊泡顆粒；

注：若沉淀較多，可12,000 ×g，2 min離心多次至無明顯沉淀，每次取上清。

四、純化和保存大型真菌囊泡

1、囊泡純化：將收獲的大型真菌囊泡顆粒粗品轉(zhuǎn)入Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃ 以3,000 ×g 離心10 min，離心后收集EPF柱管底的液體，此液體即為純化后的大型真菌囊泡顆粒；

注：a. EPF柱不可重復(fù)使用； b. 如需獲得大顆粒囊泡，可不進(jìn)行該步驟。

2、囊泡保存：純化后的大型真菌囊泡以合適體積進(jìn)行分裝凍存于-80℃低溫冰箱中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

結(jié)果展示：

粒徑及BCA結(jié)果展示

注意事項(xiàng)：

1.      試劑盒內(nèi)的Solution A溶液，可以按照單次使用量分裝，保存在-80℃，使用前4℃解凍，解凍后盡快用完，禁止反復(fù)凍融。

2.      Solution A 試劑靜置有棕黃色沉淀，屬于正常現(xiàn)象，使用前需混勻。

3.      若對內(nèi)毒素有嚴(yán)格要求，榨汁步驟請嚴(yán)格在生物安全柜下進(jìn)行，關(guān)鍵用品和儀器注意消毒后使用。

4.      純化后的大型真菌囊泡可保存在-80℃冰箱中，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致囊泡破裂。

5.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅用于生命科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷及其他用途！

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