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總RNA提取試劑盒（離心柱法）

產(chǎn)品介紹 

本試劑盒采用離心吸附柱技術(shù)和新型的溶液體系，為客戶提供一套從動物組織、植物組織、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌中純化完整、高質(zhì)量總RNA。試劑盒 采用獨特的緩沖液系統(tǒng)，快速裂解細(xì)胞，沉淀蛋白，高效專一吸附核酸分子，再經(jīng)DNA酶I處理去除基因組DNA，最終得到純度高，完整性好的 總RNA。可用于RT-PCR、Real-Time PCR、芯片分析、Northern雜交等多種下游實驗。

注意事項

1 使用前檢查各組分是否出現(xiàn)沉淀。若有，請輕輕搖晃混合均勻，或37℃水浴重新溶解。 

2 β-巰基乙醇請4℃保存，使用前在RNA裂解液中加入800μlβ-巰基乙醇至終濃度為4%，加入β-巰基乙醇的RNA裂解液于4℃保存，有效期6個 月。 

3 戴一次性干凈手套和口罩操作，防止皮膚、唾液和實驗室用品上存在的RNase污染。 

4 使用無菌無RNase的塑料制品和槍頭。 

5 若使用玻璃器皿須經(jīng)過0.1% DEPC水在37℃下浸泡12小時，然后經(jīng)過 121℃高壓滅菌30分鐘，烘干后使用。 

6 配制相關(guān)的試劑必須使用經(jīng)過121℃高壓滅菌的0.1% DEPC水。

使用流程

樣品預(yù)處理

1 組織樣品 

取10-20mg動物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入200μl RNA裂解液（已加入 β-巰基乙醇），也可將組織置于離心管中，迅速加入200μl RNA裂解液，用普通玻璃勻漿器或者電動勻漿器將組織徹底研磨均勻。

2 細(xì)胞樣品 

收集1-5×106個細(xì)胞。對于貼壁細(xì)胞，加入200μl RNA裂解液。用移液器反復(fù)吹打混勻直至細(xì)胞團消化不見為止，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管內(nèi)。對于懸浮細(xì)胞：常規(guī)桌面離心機5000rpm（約3056g）離心5min，收集細(xì)胞，每1-5×106個細(xì)胞加入200μl RNA裂解液。用移液器反復(fù)吹打混勻直至 看不到細(xì)胞團為止。

3 植物組織樣品

將液氮研磨好的粉末立即轉(zhuǎn)移到RNA裂解液中，按照每10-20mg加入200μl RNA裂解液，用移液器吹打均勻至無明顯的粉末團。

4 細(xì)菌樣品

用100μl新鮮配制的含溶菌酶的TE緩沖液重懸細(xì)菌沉淀。革蘭氏陽性細(xì)菌可使用3mg/ml(終濃度)的溶菌酶，輕輕混勻，室溫孵育5-10min，加 入200μl RNA裂解液，用槍頭吹打混勻；革蘭氏陰性細(xì)菌則采用0.4mg/ml(終濃度)的溶菌酶，輕輕敲打混勻，室溫孵育3-5min。加入200μl RNA裂解液，用槍頭吹打混勻。

RNA 提取

1 向預(yù)處理好的樣品勻漿液中加入400μl RNA中和液，混勻。室溫放置3-5min。如果動物組織樣品來源比較珍貴，可以選擇裂解物加入 400μl RNA 中和液后置于70℃加熱5min，提高RNA得率。

2 室溫，常規(guī)桌面離心機12,000rpm（~13,400×g）離心1min，小心吸取上清液到新的1.5ml無核酸酶的EP管中。

3 加入 1/2 倍上清體積的無水乙醇，用移液槍吹打3-4次以混勻。

4 將混合液全部轉(zhuǎn)移到RNA吸附柱RP20內(nèi)（吸附柱位于收集管內(nèi)），如果混合液體積大于800μl，需分批加入。每次加入的體積不超過800 μl。12,000rpm（~13,400×g）離心 1min，棄濾液。將RNA吸附柱放入收集管中。

5 向RNA吸附柱中加入600μl RNA洗滌液 I（已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心1min，棄濾液。將RNA吸附柱放入收集管中。

6 按如下比例配制DNase I反應(yīng)混合液，并輕輕混勻。

7 向 RNA 吸附柱膜中央加入50μl新鮮配制的DNase I反應(yīng)混合液，室溫靜置15min。

8 向 RNA 吸附柱中加入600μl RNA洗滌液 II（已加入無水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）離心1min，棄濾液。

9 重復(fù)步驟8 一次。將RNA吸附柱放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）離心2min ，目的是甩干管壁上殘留的RNA洗滌液 II，避免殘留的乙醇影響下游實驗。

10 將 RNA 吸附柱轉(zhuǎn)移至洗脫管中，向RNA吸附柱膜中央加入50-100μl無核酸酶水，室溫靜置2min，12,000rpm（~13,400×g）離心 1min，即得總RNA產(chǎn)物，如不立即進(jìn)行下游實驗，將RNA保存在-80℃?zhèn)溆谩?/span>

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