總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（WST-8 法）

Total Superoxide Dismutase Assay Kit with WST-8
 

產品簡介：

總SOD活性檢測試劑盒（WST-8法）利用WST-8顯色反應，通過比色法精準測定細胞、組織及其他樣本中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，靈敏度高達0.5U/mL。

SOD是生物體內關鍵的抗氧化酶，可催化超氧陰離子（O??）歧化為過氧化氫（H?O?）和氧氣（O?）。反應體系中，黃嘌呤氧化酶（XO）產生的超氧陰離子與WST-8生成水溶性甲臜染料；SOD通過清除超氧陰離子抑制該顯色反應，其活力與甲臜產量呈負相關，據此計算SOD活性。

本試劑盒特別引入過氧化氫酶，可消除樣本中內源性過氧化氫的干擾（即使H?O?濃度高達0.1mM，結果仍不受影響），適用于細胞/組織勻漿上清、全血、紅細胞裂解液及血清等多種生物樣本。

保存條件: 

-20℃避光保存（一年有效）

產品組成：

產品使用：

1.      樣品準備：

a)      細胞樣品：

對于貼壁細胞：吸凈培養液，用預冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每1×10⁶的細胞加入100-200ul的比例加入SOD樣品制備液，適當吹打以充分裂解細胞；對于懸浮細胞：600g離心5min收集細胞，用預冷的PBS或生理鹽水洗滌一遍，按照每1×10⁶的細胞加入100-200μl的比例加入SOD樣品制備液，適當吹打，以充分裂解細胞。4℃約12,000g離心3-5min，取上清作為待測樣品。

b)     組織樣品：

將動物用生理鹽水（含0.16mg/ml肝素鈉）灌流清除血液后獲取組織樣品。取適量的組織樣品，加入預冷的PBS冰浴勻漿。隨后勻漿液12000g，4℃離心3-5min，取上清液作為待測樣品。

c)      血漿/紅細胞：

用抗凝管收集血液，顛倒混勻。600g，4℃離心10min，移取上清至1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后即可。紅細胞樣品可以參考懸浮細胞樣品的制備方法。

d)     測定蛋白濃度（建議BCA法）：通常10-20μg蛋白的細胞或組織勻漿液樣品中的SOD平均活力約1個活力單位左右（不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作參考）。每種樣品準備20-100μg蛋白量通常已經足夠用于后續檢測。

e)      根據蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當稀釋樣品。準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，可以-70℃凍存，但建議盡量當天完成測定。

2.      試劑準備：

a)      WST-8/酶工作液配制（每孔160μl）：

151μl SOD檢測緩沖液+8μl WST-8+1μl 酶溶液（需先離心混勻）

根據待檢測樣品（包括標準品）的數量，配置適量的 WST-8/酶工作液：

注意：配制好的 WST-8/酶工作液 4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現配現用。由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當混勻后再使用。

b. 反應啟動工作液：

1μl 反應啟動液（40×） + 39μl SOD檢測緩沖液

根據待檢測樣品(包括標準品)的數量，配制適量的反應啟動工作液。配制好的反應啟動工作液 4℃或冰浴保存，可以在當天使用，但建議盡量現配現用。

c. （可選）SOD標準品：

需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的SOD樣品制備液（當樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時）或SOD檢測緩沖液（當樣品為血液等無需處理的樣品時）將SOD標準品稀釋至如下系列濃度：200U/ml，100U/ml，50U/ml，20U/ml，10U/ml，5U/ml，2U/ml。在隨后的檢測中可以各取20μL參考樣品進行檢測。

注：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD標準品宜現稀釋現使用；本試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標準品，但可以使用SOD標準品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。

3.      樣品檢測：

a)     參考下表使用 96 孔板設置樣品孔和各種空白對照孔。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液。加入反應啟動工作液后充分混勻。注意：加入反應啟動工作液后反應即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應啟動工作液的時間先后差異而導致的誤差。

*如果樣品有顏色或含有抗氧化物質，則需設置空白對照3；如果樣品沒有顏色并且也不含有抗氧化物則無需設置空白對照3。

b)     37℃孵育30分鐘。注：孵育25至35分鐘檢測出來的SOD活力無顯著差異，但為保證檢測結果的一致性，推薦孵育30分鐘。

c)      在450nm測定吸光度。如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。也可以選擇設定600nm（或600nm以上，如650nm）作為參比波長，450nm吸光度的讀數扣除參比波長的吸光度讀數即可作為實測讀數。

4.      結果計算：

a)      抑制百分率：

參考如下計算公式計算抑制百分率

有空白對照3：

抑制百分率 = [(A_{空白對照1} - A_{空白對照2}) - (A_樣品 - A_{空白對照3})] / (A_{空白對照1} - A_{空白對照2}) × 100%

無空白對照3：

抑制百分率 = (A_{空白對照1} - A_樣品) / (A_{空白對照1} - A_{空白對照2}) × 100%

如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要把該樣品重新測定。盡量使樣品的抑制百分率在30-70%范圍內。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當稀釋樣品；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度較高的待測樣品。

b)     酶活力單位定義：

在上述黃嘌呤氧化酶偶聯反應體系中抑制百分率為50%時，反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(unit)。注意：SOD的活力單位的定義方式有很多種，不同的活力單位需根據其定義的不同進行適當換算。

c)      酶活力計算：

SOD活力（units）=抑制百分率/(1-抑制百分率)

例如當抑制百分率為50%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝50%/(1－50%)＝1unit；當抑制百分率為60%時，待測樣品中SOD酶活力單位＝60%/(1－60%)＝1.5units。

d)     單位換算：

根據樣品的類型，細胞/組織的勻漿液/紅細胞抽提液，可以根據樣品的蛋白濃度和稀釋倍數，將SOD活力單位換算為U/g或U/mg蛋白。如果樣品為紅細胞抽提液，可以根據血紅蛋白含量，可換算為U/g血紅蛋白或U/mg血紅蛋白。

5.      可選方案：

a)     標準曲線法：可以先使用本試劑盒繪制 SOD 標準品的抑制百分率曲線，然后根據樣品檢測到的抑制百分率對比標準品的抑制百分率曲線計算出樣品中的SOD酶活力單位。本方案僅供參考，使用本試劑盒時不必使用本方案進行檢測和計算。此外，本方案需確保標準品的酶活力數據可靠，不會因為標準品的保存問題而導致實際酶活力下降。

b)     動力學法：如果條件許可，使用本試劑盒時也可以使用動力學方法檢測SOD的酶活力。通常在步驟3(a)后可以在37℃孵育同時在450nm連續測定吸光度30分鐘。根據30分鐘內的吸光度變化的斜率（K）計算出抑制百分率：

抑制百分率＝[(K_{空白對照1}－K_{空白對照2})－(K_樣品－K_{空白對照3})]/(K_{空白對照1}－K_{空白對照2})×100%

其余的計算方法同上述非動力學的計算方法。動力學方法的檢測和計算更加精確一些，但檢測起來相對要麻煩一些。使用本試劑盒通常使用非動力學方法即可。

注意事項：

1.      待測樣品可-70°C保存1個月，需注意反復凍融會導致 SOD 部分失活。

2.      樣品制備液中不可含Triton X-100等去垢劑。

3.      抗氧化物會對本試劑盒的檢測產生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid，5mM GSH 都會使測定出來的吸光度顯著升高。所以需要設置使用說明中的空白對照3來消除樣品中的抗氧化物的干擾。

4.      標準品稀釋時所用的稀釋液應盡量與樣品一致。樣品用試劑盒提供的SOD樣品制備液制備時，標準品也建議使用SOD樣品制備液進行稀釋；當樣品為血液等無需處理的樣品時，建議使用試劑盒提供的SOD檢測緩沖液稀釋標準品。

5.      酶溶液需離心混勻，避免分層。

6.      建議每樣品做復孔，提高準確性。

7.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。