Fluorescein Isothiocyanate Isomer I (FITC) 異硫氰酸熒光素

產品簡介：

異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate），縮寫FITC，是生物學應用最廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團能與蛋白上的氨基末端和首胺反應，從而將熒光素標記到蛋白上，包括抗體和凝集素。FITC的生物應用包括蛋白的熒光標記，蛋白的熒光示蹤，以及熒光抗體的病原體快速鑒定技術。FITC的最大吸收波長為495nm，呈黃-橙色；最大發射波長為525nm，呈黃-綠色。

本品為FITC的I型異構體（Isomer I），純度≥95%，適用于蛋白標記。

產品特性:

1）CAS NO：3326-32-7

2）同義名：Fluorescein isothiocyanate isomer I; Fluorescein 5-isothiocyanate;

3）分子式：C21H11NO5S

4）分子量：389.38g/mol

5） 外觀：橙色粉末

6）  純度：≥95%（HPLC）

7）  Ex/Em：492/518 nm

8）  溶解性：溶于丙酮（1mg/ml），DMSO（5mg/ml），微溶于水（＜0.1mg/ml）

9）  化學結構圖：

保存條件: 

2-8oC干燥避光保存，有效期2年。

產品使用：

1. FITC標記蛋白

1）制備溶于0.1M碳酸鈉緩沖液（pH 9.0）的待標記蛋白溶液，濃度≥2mg/ml。

【注意】：勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，因pH值會發生變化，建議現配現用。

【注意】：待標記蛋白必須是未被污染蛋白，且蛋白溶液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因為這些試劑會抑制標記反應。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃于PBS，pH 7.4透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會損害某些蛋白。

2）溶解FITC于無水DMSO配制成1mg/ml的溶液。

【注意】：建議于每次標記實驗前新鮮配置FITC溶液，避光保存。

3）對于1ml蛋白溶液加入50μlFITC溶液，可按照每次5μl的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；

4）待所需FITC加入完畢，將反應液于4℃避光孵育8h；

5）加入NH₄Cl使其終濃度至50mM，4℃終止反應2h；

6）加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；            

7）通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結合的FITC，分離范圍在20,000至50,000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。

此時，可以形成兩條帶：a，快速移動帶，也就是FITC-蛋白標記物，先被洗脫，通常于室內光下可看到；b，慢速移動帶，也就是未結合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。

8）于4℃避光儲存上述偶聯物，加入0.1%（w/v）疊氮化鈉作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1mg/ml），可加入1%BSA作為一種蛋白穩定劑。

9）標記物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495nm和280nm處的吸光值來鑒定，F/P應位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

2.熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測定

F/P摩爾比即蛋白熒光標記物中FITC與蛋白質的摩爾比。為了計算該值，首先需測定該標記物在280nm和495nm的吸光值：將已標記蛋白樣品置于石英比色皿中，測得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之間，如在該范圍外，需調整相應標記樣品濃度。

注意事項：

1.      FITC有兩種異構體：異構體I和異構體II，前者的異硫氰酸基團連接在苯環的C4位置，后者的異硫氰酸基團連接在苯環的C5位置，兩種異構體在光譜上如波長或強度上難以區分。然而，異構體I比較容易分離和純化，因此成本比較低，這也是為什么異構體I更普遍用于標記用的原因。FITC的兩種異構體混合物適合大部分實驗。

2.      為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。