Fluorescein Isothiocyanate Isomer I (FITC) 異硫氰酸熒光素

產(chǎn)品簡介：

異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate），縮寫FITC，是生物學(xué)應(yīng)用最廣泛的一種綠色熒光素衍生物，其異硫氰酸基團(tuán)能與蛋白上的氨基末端和首胺反應(yīng)，從而將熒光素標(biāo)記到蛋白上，包括抗體和凝集素。FITC的生物應(yīng)用包括蛋白的熒光標(biāo)記，蛋白的熒光示蹤，以及熒光抗體的病原體快速鑒定技術(shù)。FITC的最大吸收波長為495nm，呈黃-橙色；最大發(fā)射波長為525nm，呈黃-綠色。

本品為FITC的I型異構(gòu)體（Isomer I），純度≥95%，適用于蛋白標(biāo)記。

產(chǎn)品特性:

1）CAS NO：3326-32-7

2）同義名：Fluorescein isothiocyanate isomer I; Fluorescein 5-isothiocyanate;

3）分子式：C21H11NO5S

4）分子量：389.38g/mol

5） 外觀：橙色粉末

6）  純度：≥95%（HPLC）

7）  Ex/Em：492/518 nm

8）  溶解性：溶于丙酮（1mg/ml），DMSO（5mg/ml），微溶于水（＜0.1mg/ml）

9）  化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

2-8oC干燥避光保存，有效期2年。

產(chǎn)品使用：

1. FITC標(biāo)記蛋白

1）制備溶于0.1M碳酸鈉緩沖液（pH 9.0）的待標(biāo)記蛋白溶液，濃度≥2mg/ml。

【注意】：勿將碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液存放于0-5℃超過1周，因pH值會發(fā)生變化，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

【注意】：待標(biāo)記蛋白必須是未被污染蛋白，且蛋白溶液里不能含有疊氮鈉或胺類試劑，如Tris、甘氨酸，因為這些試劑會抑制標(biāo)記反應(yīng)。如果緩沖液里含有上述試劑，則需將該蛋白溶液在4℃于PBS，pH 7.4透析過夜；透析過程中如果pH值過高（＞8.0-8.5）會損害某些蛋白。

2）溶解FITC于無水DMSO配制成1mg/ml的溶液。

【注意】：建議于每次標(biāo)記實(shí)驗前新鮮配置FITC溶液，避光保存。

3）對于1ml蛋白溶液加入50μlFITC溶液，可按照每次5μl的量邊加邊輕輕攪拌蛋白溶液；

4）待所需FITC加入完畢，將反應(yīng)液于4℃避光孵育8h；

5）加入NH₄Cl使其終濃度至50mM，4℃終止反應(yīng)2h；

6）加入二甲苯青至濃度0.1%，甘油至濃度5%；            

7）通過大小孔徑合適的凝膠過濾層析分離排除未被結(jié)合的FITC，分離范圍在20,000至50,000（球蛋白例如抗體）。待凝膠柱平衡后，將以上反應(yīng)混合液從柱頂注入，打開凝膠柱，待其全部流入柱床后，加入PBS緩沖液。

此時，可以形成兩條帶：a，快速移動帶，也就是FITC-蛋白標(biāo)記物，先被洗脫，通常于室內(nèi)光下可看到；b，慢速移動帶，也就是未結(jié)合蛋白的FITC和二甲苯青。僅僅在PBS緩沖液清洗后被洗脫出來。

8）于4℃避光儲存上述偶聯(lián)物，加入0.1%（w/v）疊氮化鈉作為一種防腐劑。若蛋白濃度較低（＜1mg/ml），可加入1%BSA作為一種蛋白穩(wěn)定劑。

9）標(biāo)記物中熒光素和蛋白的比值（F/P）可通過測定495nm和280nm處的吸光值來鑒定，F/P應(yīng)位于0.3-1.0。小于該比例則信號太低，高于該比例則背景太高。

2.熒光素/蛋白摩爾比（F/P）的測定

F/P摩爾比即蛋白熒光標(biāo)記物中FITC與蛋白質(zhì)的摩爾比。為了計算該值，首先需測定該標(biāo)記物在280nm和495nm的吸光值：將已標(biāo)記蛋白樣品置于石英比色皿中，測得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之間，如在該范圍外，需調(diào)整相應(yīng)標(biāo)記樣品濃度。

注意事項：

1.      FITC有兩種異構(gòu)體：異構(gòu)體I和異構(gòu)體II，前者的異硫氰酸基團(tuán)連接在苯環(huán)的C4位置，后者的異硫氰酸基團(tuán)連接在苯環(huán)的C5位置，兩種異構(gòu)體在光譜上如波長或強(qiáng)度上難以區(qū)分。然而，異構(gòu)體I比較容易分離和純化，因此成本比較低，這也是為什么異構(gòu)體I更普遍用于標(biāo)記用的原因。FITC的兩種異構(gòu)體混合物適合大部分實(shí)驗。

2.      為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。