Magneti-Q Anti-HA Beads

產品介紹

1 HA標簽

血凝素（英文 hemagglutinin）是指紅血球凝聚素，血凝素具有免疫原性，抗血凝素抗體可以中和血凝素。HA標簽是一段來源于人流感病毒血凝素蛋白第98～106位氨基酸的短序列，氨基酸序列為 YPYDVPDYA，HA標簽的分子量為 1.1 KDa，是目前廣泛應用的標簽之一。通過重組DNA技術將HA標簽融合到目的蛋白的C端或N端后，有利于對目的蛋白進行純化和檢測。

2 Anti-HA抗體

Anti-HA抗體可以用于檢測和HA標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，也可以用于HA融合表達蛋白的純化、定性或定量檢測。本公司的Anti-HA親和力較高，適合做WB、IP等蛋白互作實驗，也適用于化學發光或者熒光方法進行檢測。

3 磁珠性質

Magneti-Q Anti-HA Beads是將高濃度的HA抗體偶聯至瓊脂糖磁珠上，可直接用于HA融合蛋白的純化。磁珠性能見表1。

表1. Magneti-Q Anti-HA Beads產品性能

使用方法

1 緩沖液準備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 μm或0.45 μm濾膜過濾。

平衡/洗雜液：PBST（1×PBS + 0.02% Tween-20，pH 7.4）

酸性洗脫液：0.1 M glycine HCl，pH3.0

競爭性洗脫液：50 mM Tris，0.15 M NaCl，100–500 μg flag多肽/ml，pH 7.4

中和液：1 M Tris-HCl，pH8.0

2 清洗磁珠

1）將磁珠充分混勻后取100 μl磁珠混懸液置于離心管中放磁力架上靜置，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

2）加入500μl平衡液輕輕顛倒混勻3次；

3）將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

4）重復上述操作3次。

注：可根據樣本量增加磁珠混懸液的體積（如：1 ml樣本加入100 μl磁珠混懸液；2 ml樣本加入200 μl磁珠混懸液）。

3 樣品前處理

真核表達的分泌蛋白可直接取培養上清離心。真核或原核表達的胞內蛋白可用裂解液或超聲的方法破碎細胞后離心取上清，再進行后續步驟。若樣品中含有核酸雜質會吸附在磁珠上，導致雜蛋白變多。除去核酸常用兩個方法：

1）充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也會造成蛋白降解；

2）使用超級核酸酶消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。

低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類團塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

4 樣品孵育

1）向上述漂洗好的磁珠中加入1 ml樣品，2–8℃或常溫下孵育30–60 min（建議在旋轉混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）；

2）孵育結束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉移至新的離心管中，留樣備檢；

3）向離心管中加入500μl洗雜液，輕輕顛倒混勻5–10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清；

4）重復上述清洗操作5次。

注：蛋白純化需要控制溫度，在2–8℃下孵育有助于防止蛋白降解。操作時間也至關重要，有時候快速進行實驗比加入蛋白酶抑制劑更能保護目的蛋白。建議樣品孵育時間不要超過60分鐘，磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置3–5分鐘，使雜蛋白從磁珠孔隙中充分溶出。

5 蛋白洗脫

1）每100–200μl磁珠混懸液加入100μl洗脫液，常溫或4℃洗脫5–10 min，期間輕輕混勻3–5次；

2）孵育結束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，重復洗脫三次。洗脫蛋白需要分管收集，分別電泳確定純度。

6 蛋白洗脫液的選擇

1）酸性洗脫：一般為pH = 2.5–3.0的甘氨酸或者檸檬酸，酸洗脫可有效打開抗體與標簽之間的相互作用，但由于大部分蛋白僅能耐受pH 5.5以上的條件，酸洗脫對保持標簽蛋白的活性有害，如果不確定融合蛋白可以耐受酸性緩沖液可以進行預實驗，洗脫后的蛋白加入1–2 M Tris (pH = 8.0–8.5) 快速調節pH恢復中性；

2）多肽競爭洗脫：多肽洗脫可以獲得高活力的蛋白，但多肽競爭洗脫的效率較低，磁珠上會有目的蛋白的殘留。

注意事項

1）本產品保存在2–8℃冰箱中，不可凍結保存；

2）本產品出現輕微團聚屬正常現象，可正常使用；

3）本產品不要使用含有DTT等還原劑的細胞裂解液樣品，DTT可能會導致抗體配體的脫落；

4）本產品能耐受≤2 M尿素，高濃度的尿素會導致抗體配體脫落；

5）在清洗和洗脫時避免吸取到磁珠，清洗時吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時吸取到磁珠會影響目的蛋白的質量和電泳效果，第一次洗脫后可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進行吸附；

6）本產品不能夠直接高溫加熱磁珠，高溫加熱磁珠將造成抗體大量脫落，后進行電泳條帶較多，影響對實驗結果的判斷。

參考信息

1）分泌蛋白純化：

a. 取2 ml培養基上清，高速離心去除顆粒沉淀；

b. 加入已經漂洗過的100 μl磁珠懸浮液，混合均勻后放置旋轉混勻儀上，室溫孵育1 h；

c. 將含有磁珠的樣品管轉移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

d. 用PBST清洗5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育10 min，重復洗脫三次；

e. 對洗脫產物進行SDS-PAGE電泳，

常見問題與解答

1）聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區別？

a. 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在30–100μm，交聯時很大一部分配體會進入球孔內部，所以偶聯載量相對較高，非常適用蛋白的快速純化；而聚合物磁珠通常粒徑為1–3μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結合蛋白，空間位阻影響小，非常適合于蛋白互作實驗，但其載量不高；

b. 我們推薦使用瓊脂糖磁珠進行蛋白純化實驗；使用聚合物磁珠進行蛋白互作實驗如IP、Co-IP和pull down實驗等。

2）為何純化不到目的蛋白？

a. 可能是由于蛋白表達量低造成的，建議在純化前用WB或者SDS-PAGE檢測下蛋白原始表達量，如果WB信號很弱或者無信號，目的蛋白很難純化到；

b. 可能由于洗脫方式不合適造成，建議根據自己的實驗目進行洗脫；

c. 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質，建議用合適的裂解液。