rProtein A/G MagPoly Beads

產(chǎn)品介紹

rProtein A/G MagPoly Beads（蛋白 A/G聚合物磁性微球）是 rProtein A/G高密度定向包被到超順磁性聚合物微球表面，該產(chǎn)品具有更高的 抗體結(jié)合能力和較低的蛋白非特異吸附率 ，一步純化即可從血清樣品中分離出純度大于 90%的抗體。產(chǎn)品性能見(jiàn)表 1；用戶可根據(jù)目標(biāo)抗 體的種屬來(lái)源及亞型選擇微球的類別 ，Protein A ，Protein G和 Protein A/G與不同抗體的親和性比較參見(jiàn)附表。

表1.rProtein A/G MagPoly Beads產(chǎn)品性能

操作步驟

本操作流程主要為免疫沉淀反應(yīng)，每次反應(yīng)使用 50μl rProtein A/G MagPoly Beads為例，可根據(jù)需要適當(dāng)?shù)脑黾踊驕p少磁珠使用量。

1 緩沖液的準(zhǔn)備

 所用水和緩沖液在使用之前建議用 0.22μm或 0.45μm濾膜過(guò)濾。

裂解緩沖液：50mM Tris-HCl ，0. 15M NaCl ，1% IGEPAL-CA630 ，1mM PMSF ，pH7.4 

平衡/洗雜液：0. 15M NaCl ，20mM Na2HPO4 ，pH7.0 

洗脫液：0. 1M 甘氨酸 ，pH3.0 

中和液：1M Tris-HCl ，pH8.5 

交聯(lián)液：0.2M三乙醇胺 ，pH8.2 

交聯(lián)劑：DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride） 

終止液：50mM Tris-HCl ，pH7.5

2 樣品準(zhǔn)備 

方案 I: 貼壁細(xì)胞的裂解 

1) 小心去除單層細(xì)胞的培養(yǎng)基。 

2) 用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞兩次。 

3) 根據(jù)表2的推薦體積向細(xì)胞中加入預(yù)冷裂解緩沖液。冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。 

4) 將上述裂解好的樣品轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，約13,000 ×g 離心10 min，分離細(xì)胞碎片。 

5) 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

表2.針對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿的裂解緩沖液的推薦使用體積

方案 II：懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的裂解

1) 將細(xì)胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細(xì)胞，棄上清。

2) 用預(yù)冷 PBS將細(xì)胞團(tuán)輕輕重懸，將細(xì)胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細(xì)胞，棄上清。

3) 向細(xì)胞團(tuán)塊中加入預(yù)冷裂解緩沖液。每 50 mg細(xì)胞團(tuán)塊使用 500 μl。

4) 將上述裂解好的樣品在冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。13,000×g離心 10 min，去除細(xì)胞碎片。

5) 將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管中，備蛋白濃度測(cè)定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)記為細(xì)胞裂解樣品。

3 磁珠準(zhǔn)備

1)將 rProtein A/G MagPoly Beads顛倒或漩渦混合均勻。

2)取 50μl rProtein A/G MagPoly Beads加入新的離心管中。放置在磁分離器上 ，待溶液變澄清后 ，用移液器吸棄保護(hù)液。

3)將離心管從磁分離器上取下來(lái)，加入 200μl平衡液，混勻，放置在磁分離器上 ，收集磁珠，用移液器吸棄保護(hù)液。重復(fù)洗 2次。

4 抗體吸附

1) 加入抗體溶液（5-25μg抗體總量） ，充分混勻 ，體積不足 500μl時(shí)用平衡液補(bǔ)足。

2) 室溫孵育 10min以上（具體時(shí)間根據(jù)結(jié)合效果調(diào)整） ，可以振蕩或漩渦混合均勻。

3) 將離心管置于磁分離器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸棄上清液。如需要可留做進(jìn)一步檢測(cè)。

4) 加入 500μl洗雜液混合均勻 ，置于磁分離器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸棄上清液。重復(fù)洗雜至少 3次。

5 抗體交聯(lián)（備選）

1) 如果需要將抗體和目標(biāo)抗原復(fù)合物共同洗脫 ，請(qǐng)忽略本步驟 ，直接進(jìn)行操作6。

2) 加入 1ml交聯(lián)液 ，振蕩懸浮 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。該操作重復(fù)兩次。

3) 再加入 1ml含有 20mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交聯(lián)液 ，此試劑需要現(xiàn)用現(xiàn)配。振蕩懸浮，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混 合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 ，促使溶液和磁珠充分接觸 ，約 30min后 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。

4) 使用 1ml終止液懸浮磁珠 ，終止交聯(lián)反應(yīng) ，在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 ，促使溶液和磁珠充分接觸 ，約 15min后 ， 置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。

5) 加入 1ml平衡液 ，顛倒混勻 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。再重復(fù)兩次。

6 抗原結(jié)合反應(yīng)

1) 加入含有抗原的細(xì)胞裂解樣品（步驟 2，通常 100-1000μl)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復(fù)合物均勻分散。

2) 在室溫下置于翻轉(zhuǎn)混合儀或者手工輕輕翻轉(zhuǎn)離心管 10min，使抗原與抗體充分結(jié)合，如結(jié)合力較弱則可在室溫下反應(yīng) 1h或者在 4℃下反應(yīng) 過(guò)夜。

3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復(fù)合物進(jìn)行磁性分離 ，收集上清液 ，以備后續(xù)檢測(cè)。

4) 向離心管中加入 1ml洗雜液 ，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復(fù)合物均勻分散 ，然后進(jìn)行磁性分離 ，棄上清液；從磁分離器上取下 離心管 ，再重復(fù)洗滌兩次。

7 抗原洗脫

方案一 變性洗脫

此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE檢測(cè)。

1) 從磁分離器上取下離心管 ，向其中加入 25μl 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻 ，95℃加熱 10min。

2) 置于磁性分離器上 ，進(jìn)行磁性分離 ，或者離心 ，收集上清液進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)。

方案二 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復(fù)合物中加入 300μl洗脫液 ，混合均勻 ，室溫孵育 10min。

2) 置于磁性分離器上 ，進(jìn)行磁性分離 ，吸取上清為洗脫液至新的離心管中。

3) 重復(fù)步驟 1）和 2）兩次 ，收集洗脫液 ，與 2）收集洗脫液混合 ，加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

*附表. Protein A、 Protein G 和 Protein A/G 對(duì)不同抗體的結(jié)合能力

++++：結(jié)合能力強(qiáng)；++：結(jié)合能力中等；—：結(jié)合能力弱或沒(méi)有結(jié)合。