GST Protein Pull Down Kit

???產品介紹 

Glutathione Beads 4FF可以一步純化各種表達系統表達的谷胱甘肽-S-轉移酶、谷胱甘肽依賴型蛋白和谷胱甘肽轉移酶的重組衍生物。另 外試劑盒內經過優化的緩沖液，為蛋白互作實驗提供了最佳的反應條件，增強了蛋白互作實驗的穩定性，更有效的去除實驗背景。本產品可廣 泛應用于大腸桿菌裂解物、細胞裂解物、細胞分泌上清等樣品中的蛋白互作驗證，具體組分見表1。

?表1.GST Protein Pull Down Kit產品組分

注：表格中標注的為填料實際體積（填料：保護液=1:1），如0.15ml填料的混懸液體積為0.3ml。

使用方法 

1 緩沖液的準備 

可使用試劑盒準備的緩沖液，也可根據實際情況配制不同的緩沖液體系。所有緩沖液在使用前建議用0.22μm或0.45μm濾膜過濾，緩沖液 建議4℃保存，若試劑渾濁，請立即丟棄。 

下列可能用到的試劑及材料未提供，需額外準備： 

1）電泳上樣緩沖液（SDS Loading Buffer），非還原性（5×）：0.3M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50%甘油，0.5%溴酚藍； 

2）二硫蘇糖醇（DTT）； 

3）蛋白酶抑制劑； 

4）蛋白互作所用誘餌蛋白、靶蛋白。 

2 樣品準備 

方案 I: 大腸桿菌細胞的裂解 

1）按照適當方法進行細菌培養、誘導、離心收菌，先加入Balance/Wash Buffer（添加比例：1g菌體加入9ml），震蕩完全分散菌體，加入Lysis Buffer A(添加比例：1g 菌體加1ml)。混合均勻后室溫裂解5-10min，菌體懸液漸漸變清亮透明。 

2）按菌體懸液總體積加入1/1000體積的Lysis Buffer B（如10ml已裂解菌液加入10μl Lysis Buffer B），混合均勻后，消化核酸反應 5-10min，反應后菌液應不粘稠。

3）按照適當方法離心（例如：12000×g，5-10min），分離上清與沉淀。如果是可溶蛋白，直接取上清進行使用，如果是包涵體，則取沉淀，對包涵 體進行洗滌以及變性復性。 

注：如裂解終產物較為渾濁，或樣品中目的蛋白豐度較低，可調整Lysis Buffer A的使用量。 

方案 II：哺乳動物細胞的裂解 

 1）將細胞懸液以1000×g離心5min，收集細胞，棄上清。 注：如果是貼壁細胞，通過胰蛋白酶消化將其從培養容器表面釋放。 

 2）用預冷的Balance/Wash Buffer 將細胞團輕輕重懸，將細胞懸液以1000×g離心5min，收集細胞，棄上清。同時配制裂解液，配方為 Balance/Wash Buffer：Lysis Buffer A=7：3，配制好后置于冰上預冷。 

 3）向細胞團塊中加入上述步驟2）的預冷裂解液。每50mg細胞團塊使用500μl。 

 4）將上述的樣品在冰上孵育30min，期間混勻幾次，13000×g離心10min，去除細胞碎片。 

 5）將上清轉移到一個新管中，準備蛋白濃度測定及后續實驗，標記為細胞裂解樣品。 

注：如果互作蛋白與核酸存在相互作用，可加入Lysis Buffer B(1000×)進行樣本處理。 

3 蛋白互作 

A. 填料平衡 

1）將 Glutathione Beads 4FF 充分混勻，取 50μl 加入到裝有墊片的Pull-down Column Accessory 內管中（填料實際體積占懸液一半，即實際 填料為25μl）。 

2）取下紅色堵頭，可用掌上離心機或其他微量離心機6000rpm瞬時離心，去除填料保存液。 

3）堵住下堵頭，每次取500μl的Balance/Wash Buffer加入到填料中，充分混勻填料與液體后，取下堵頭瞬時離心，甩去管內液體并將液體丟 棄，填料重復平衡3-5次后待用。 

注：填料不可長時間干涸，且每次清洗、上樣、洗脫均需吹打混勻填料與樣品。 

B. 上樣誘餌蛋白 

堵住下堵頭，向上述平衡好的填料（步驟A）中加入誘餌蛋白，如誘餌蛋白為純樣，根據填料載量推薦上樣量為250μg，如是裂解產物，可根據跑膠條帶或者直接上樣。建議上樣前用Balance/Wash Buffer稀釋補充體積至500μl，離心柱管最大裝載體積為800μl，室溫混旋孵育 30min 以上。 

注：非離心時，離心柱管應用堵頭封閉下出水口。孵育溫度和時間范圍推薦為：室溫、30min-2h，或者4℃、1h-16h，根據實際的結合效果進行調整。 

C. 上樣靶蛋白 

1）誘餌蛋白孵育完成后，取下堵頭，將孵育完成的填料（步驟B）瞬時離心甩干液體（上清留樣，用于后續檢測）。 

2）每次取500μl的Balance/Wash Buffer 加入到孵育完成的填料中，充分混勻填料與液體后，進行瞬時離心，填料重復清洗3-5次后待用。 

3）如洗雜效果不佳，可加入Wash Buffer Enhanced（GST）進行增強洗雜，后續步驟清洗時，同樣需要使用Wash Buffer Enhanced（GST）。如果上一步清洗滿足需求，可跳過此步驟。 

4）堵住下堵頭，將帶有靶蛋白的裂解液或上清加入到清洗后的填料中，如需進行稀釋，可用Balance/Wash Buffer將樣本稀釋至500ul，室 溫 孵育1h以上。 

注：孵育溫度和時間范圍推薦為：室溫、1h-2h，或 者 4℃、1h-16h，根據實際的蛋白互作效果進行調整。 

5）孵育完成后離心甩去液體（上清留樣，用于后續檢測），每次取500μl的Balance/Wash Buffer加入到孵育完成的填料中，充分混勻填料與 液體后，進行瞬時離心，填料重復清洗3-5次，最后一次清洗可以將介質-誘餌蛋白-靶蛋白復合物轉移至一個新的Pull-down Column Accessory 外管中進行。

4 洗脫方案 

方案I: 競爭\酸\變性洗脫 

1）本試劑盒提供GSH粉末，用分析天平稱取3.1mg GSH，加入到1ml的Balance/Wash Buffer或Wash Buffer Enhanced（GST）中稀釋成 終濃度為10mM谷胱甘肽洗脫緩沖液（現用現配），然后用NaOH調至中性，吸取150-250μl配制好的GST洗脫液加入到清洗好后的填料中， 充分混勻填料與洗脫液后，進行離心并收集洗脫液。如洗脫效果不佳，則可提高谷胱甘肽濃度或多次洗脫。 

2）使用甘氨酸（pH 3.0）同樣可以洗脫蛋白，此方案需要自備試劑，甘氨酸（pH 3.0）洗脫可能會損傷蛋白，并且使用后需要用1M Tris，pH 8.5 進行中和。 

3）使 用 SDS Loading Buffer 亦可進行洗脫，SDS Loading Buffer 洗脫能力較強，可以洗脫填料上的絕大部分蛋白（包括非特異性吸附），但是會使蛋白失活，無法維持三維結構。 

方案 II：煮球 

用150-250μl Balance/Wash Buffer 或 Wash Buffer Enhanced（GST）重懸填料，直接將填料混合物取出添加SDS Loading Buffer， 95-100℃煮樣10min，12000rpm離心10min后取上清進行跑膠。 

注意事項 

1）在進行蛋白互作操作之前，請務必認真閱讀此說明書。 

2）除非另有說明，所有操作建議于4℃下進行。 

3）填料應保存在儲存溶液中，防止干燥，使用前請充分混勻。 

4）如果需要在還原條件下洗脫，向1×電泳上樣緩沖液中加入DTT (終濃度10-20mM)。 

5）經煮沸后的填料失去結合能力，經煮沸的填料不應再次使用。 

6）為保證最佳的實驗結果，請選擇純度較高的誘餌蛋白進行蛋白互作。 

7）對于蛋白互作實驗，不同類的誘餌蛋白與靶蛋白結合的親和性是有區別的，因此若本試劑盒提供的緩沖體系不能獲得很好的實驗結果，可自行優化緩沖液進行實驗。 

8）實驗設計時，建議加入對照組，以備后續實驗結果分析。 

9）在確定實驗結果前，建議保留各步驟的樣品以備驗證（如input、流穿、洗雜、洗脫、煮球）。