細胞培養污染拯救及預防方法

§ 污染是細胞培養的大敵。預防和避免污染是細胞培養成功的關鍵之一。

§ 一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。

（一）污染的類型

§ 細胞培養過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養環境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質，包括生物和化學物質。

1、細菌污染

§ 細菌污染是實驗室細胞培養中常見的污染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

§ 培養細胞受細菌污染后，會出現培養液變混濁，pH改變。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

2、真菌污染

§ 真菌污染是細胞培養過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

§ 培養細胞受真菌污染后，可見培養液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養液一般不發生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。

§ 真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

3、支原體污染

§ 支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態結構。開始不易發現，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。

§ 培養細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產生交叉污染。

                   陽性                                                  陰性

4、病毒污染

§ 組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少于20種血清性病毒。

§ 盡管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

5、非同種細胞污染

§ 由于細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。

§ 非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生，大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。

（二）、污染的鑒別

1、細菌、真菌污染的檢測

§ （1）肉眼觀察  

§ 細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

§ （3）接種觀察  

§ 采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發現是否有污染。

§ （2）鏡下觀察  

§ 在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。

§ 若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

2、支原體污染的檢測

§ （1）相差顯微鏡觀察

§ 直接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現。

§ 應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區別。

§ （2）熒光染色法觀察  

§ 用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

A positive

§ （3）電鏡檢測  

§ 若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

§ （4）培養檢測  

§ 將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天后觀察肉湯培養有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現。

3 、病毒的檢測

§ 1) 應用電鏡技術快速診斷動物病毒病

§ 2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒

（三）、污染的清除

§ 培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。

§ 若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

一、細菌和真菌的清除

§ 1、使用抗生素

§ 抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。

§ 預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期有效。

（二）、支原體的清除

§ １、用MRA處理

§ 用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康．

§ 效果好．

§ 2、用清洗純化法清除支原體污染的方法

§ 細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌

§ 其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至極限.

§ 如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

§ 3、藥物輔助加溫處理

§ 先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

４、使用支原體特異性血清

§ 用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。

§ 但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。

（四）、污染的預防

§ 預防是防止細胞培養過程中發生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到最小程度。

§ 一般預防可從以下幾方面著手：

1、添加抗生素

2、從物品、用品消毒滅菌著手

§ 細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。

§ 操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

3、從操作者做起

§ （1）進無菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

§ （2）操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

§ （3）操作時要常更換吸管，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

4、防止細胞交叉污染

§ 在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分。

§ 在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。

§ 細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生污染可重新復蘇培養。

５、無菌室的徹底消毒

§ 1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室；

§ 2）甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。