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細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

欄目:技術(shù)支持
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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

1、掌屋凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征
  2、學(xué)會(huì)用熒光探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記來(lái)檢測(cè)正常活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界,在生物個(gè)體和生存中起著非常重要的作用。它是細(xì)胞在一定生理?xiàng)l件下一系列順序發(fā)生事件的組合,是細(xì)胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過(guò)程。細(xì)胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。

在形態(tài)上可見(jiàn)凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞脫離接觸,細(xì)胞變園,細(xì)胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、細(xì)胞核固縮破裂呈團(tuán)塊狀或新月?tīng)罘植肌?nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)一步融合將細(xì)胞分成多個(gè)完整包裹的凋亡小體,凋亡小體最后被吞噬細(xì)胞吞噬消化。在凋亡過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)容物并不釋放到細(xì)胞外,不會(huì)影響其它細(xì)胞,因而不引起炎癥反應(yīng)。

在生物化學(xué)上,多數(shù)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化,活性增加。核DNA隨機(jī)地在核小體的連接部位被酶切斷,降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對(duì)核DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳,可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNA ladder(梯狀帶紋)的特征。

相比之下,壞死是細(xì)胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細(xì)胞死亡。細(xì)胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性,各種細(xì)胞器膨脹,進(jìn)而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物,引起炎癥反應(yīng),壞死過(guò)程中細(xì)胞核DNA雖也降解,但由于存在各種長(zhǎng)度不等的DNA片斷,不能形成梯狀帶紋,而呈彌散狀。

一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時(shí),也可產(chǎn)生細(xì)胞壞死,這取決于損傷的劇烈程度和細(xì)胞本身對(duì)刺激的敏感程度。

三尖杉酯堿(HT)是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病,急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí),即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡,并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí),質(zhì)膜不完整,PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部,它可嵌入到DNA或RNA中,使壞死細(xì)胞著色,凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì),可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞,因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱,它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T)堿基區(qū)),顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

三、實(shí)驗(yàn)用品

1、試劑:三尖杉酯堿(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA緩沖液、堿性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸鈉:3mol/L KAc(pH4.8);異丙醇;70%乙醇;溴酚藍(lán),蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液,1%瓊脂糖,溴乙錠。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。
  2、儀器設(shè)備:熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量加樣器(1ml,100μl)0.5、1.5ml離心管載玻片,蓋玻片。

四、實(shí)驗(yàn)材料

人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。

五、方法步驟

1、三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細(xì)胞凋亡
  (1)實(shí)驗(yàn)前約24小時(shí),接種兩瓶HL-60細(xì)胞,標(biāo)記①、②,每瓶含約6ml培養(yǎng)液,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
  (2)實(shí)驗(yàn)前約2.5小時(shí),當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%,①號(hào)瓶加入三尖杉酯堿200μl,使終濃度為1μg/ml,②號(hào)瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作對(duì)照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時(shí)。

2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細(xì)胞
  (1)染色:將瓶中的細(xì)胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分鐘。
  (2)滴片:取一載玻片用雙面膠圍成一小室,從離心管中各取以上染色后的細(xì)胞懸液10μl,加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片,熒光鏡下用紫外激發(fā)光,高倍鏡下觀察,區(qū)別三種細(xì)胞,并注意三者比例。

六、注意事項(xiàng)

1、誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確;
  2、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí),由于熒光易碎滅,觀察時(shí)要盡量快。


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